高通量酵母雙雜交平臺(tái)的建立及其在蛋白質(zhì)相互作用組學(xué)當(dāng)中的應(yīng)用.pdf

1、蛋白質(zhì)通過(guò)相互作用所形成的具有一定拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的互相關(guān)聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)是生物體進(jìn)行復(fù)雜生命活動(dòng)的基礎(chǔ). 通過(guò)傳統(tǒng)的手段進(jìn)行逐個(gè)的蛋白相互作用研究來(lái)逐步構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用圖譜是一件無(wú)法完成的任務(wù),但是研究者又如何擺脫"盲人摸象"的尷尬,而從一個(gè)更加宏觀的角度審視全蛋白組范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)相互作用的情況呢?高速發(fā)展的自動(dòng)化技術(shù)為生物學(xué)研究者提供了全新的理念和手段.大多數(shù)的重復(fù)性試驗(yàn)操作可以通過(guò)程序控制的機(jī)器人高效率自動(dòng)化完成,這樣既把試驗(yàn)人員從繁

2、重的實(shí)驗(yàn)室勞動(dòng)中解放出來(lái),使他們有精力進(jìn)行數(shù)據(jù)的整合和分析。 人類蛋白質(zhì)組學(xué)計(jì)劃(Human Proteomics Project,HPP)是繼人類基因組學(xué)計(jì)劃之后,為了更加深入的解析人類生命活動(dòng)的內(nèi)在規(guī)律而啟動(dòng)的又一項(xiàng)全世界范圍內(nèi)的大型合作研究計(jì)劃.研究人員已經(jīng)不再滿足于DNA水平的知識(shí),將目光匯聚于蛋白質(zhì)組的系統(tǒng)研究上來(lái). 基因組中絕大部分基因及功能仍然處于未知狀態(tài),需要從蛋白質(zhì)水平予以解釋.基因組決定生命體的基

3、本形式,而蛋白質(zhì)組決定生命的多樣性、復(fù)雜性及其功能.蛋白質(zhì)組是指"一種基因組所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)的集合".其研究可以實(shí)現(xiàn)與基因組的對(duì)接與確認(rèn),直接揭示人類重大疾患發(fā)生與發(fā)展的病理機(jī)制. 人類蛋白質(zhì)相互作用圖譜(HumanProtein-Protein Interaction Map,HPPIM)是蛋白質(zhì)組學(xué)計(jì)劃當(dāng)中重要的一個(gè)組成部分.蛋白質(zhì)相互作用組學(xué)在這個(gè)背景之下方興未艾.通過(guò)自動(dòng)化高通量的技術(shù)平臺(tái),研究者已經(jīng)可以利用多種手段

4、構(gòu)建人類蛋白質(zhì)相互作用的連鎖圖,其中高通量酵母雙雜交就是一個(gè)重要的方法。傳統(tǒng)酵母雙雜交費(fèi)時(shí)費(fèi)力,無(wú)法完成組學(xué)計(jì)劃的任務(wù). 本文在已有試驗(yàn)技術(shù)的基礎(chǔ)上,逐步摸索并初步建立了大規(guī)模酵母雙雜交的技術(shù)平臺(tái),并己應(yīng)用到了人類蛋白質(zhì)相互作用連鎖圖的構(gòu)建過(guò)程中. 在此基礎(chǔ)上,本文獲得了大量的人類蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù),并且初步構(gòu)建了人類蛋白質(zhì)相互作用圖.后續(xù)的研究可以分為兩個(gè)方面：一對(duì)于其中的重要而且尚未報(bào)道的相互作用進(jìn)行深入的研究,揭示其生理

5、生化意義；二利用積累的數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析和預(yù)測(cè),對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和評(píng)估. 本論文以高通量酵母雙雜交技術(shù)平臺(tái)的初步建立過(guò)程入手,轉(zhuǎn)入對(duì)篩選得到的具體蛋白質(zhì)相互作用進(jìn)行深入研究. 首先,本文篩選得到了人類蛋白質(zhì)MRK β與MSKl這對(duì)相互作用.MRKβ是MAPK途徑當(dāng)MAKPKKK家族成員,它具有一個(gè)N端催化結(jié)構(gòu)域,參與蛋白質(zhì)的磷酸化修飾.MSKl是MAPK途徑當(dāng)中關(guān)鍵的激酶,直接參與調(diào)控核內(nèi)重要轉(zhuǎn)錄因子如CREB

6、、ATFl以及NFkBp65等的活性,并且是多種癌癥和炎癥的潛在藥物靶點(diǎn). 最近已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn).該蛋白包括兩個(gè)激酶結(jié)構(gòu)域,通過(guò)一個(gè)調(diào)控序列連接起來(lái).N端的結(jié)構(gòu)域(N-terminal Kinase,NTK)屬于AGC激酶家族,參與對(duì)其底物的磷酸化.C端的結(jié)構(gòu)域(C-terminalKinase,CTK)屬于CamK家族,目前認(rèn)為它對(duì)N端有激活作用.通過(guò)生物信息分析本文發(fā)現(xiàn),MRK β的N端激酶區(qū)域與p38、ERK的磷酸化結(jié)

7、構(gòu)域具有高度的保守性.有報(bào)道推斷調(diào)控MSKl的除了p38和ERK1/2之外,目前為止似乎沒(méi)有其他蛋白參與這個(gè)過(guò)程的信號(hào)調(diào)控,而這與MSK1功能非常相似RSK則不同.RSK除了受到ERK的磷酸化調(diào)控之外還受到PDK1的磷酸化修飾,而PDKl與ERK,p38和MRK β在磷酸化的domain上具有高度的保守性.本文通過(guò)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)和亞細(xì)胞免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)證實(shí)了MRK β與MSKl之間的特異性相互作用,并且通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)M

8、RK β能夠?qū)SK1磷酸化.體外和體內(nèi)試驗(yàn)表明MRK β可以通過(guò)磷酸化激活MSKl,并且進(jìn)一步激活下游的轉(zhuǎn)錄因子CREB. 這表明MRK β參與了MSK1的磷酸化過(guò)程,從而調(diào)控信號(hào)在細(xì)胞中的傳導(dǎo),影響下游基因的轉(zhuǎn)錄.這對(duì)于經(jīng)典的MAPK途徑中MSK1的激活途徑可能是一個(gè)新的發(fā)現(xiàn)和補(bǔ)充.本文進(jìn)一步利用質(zhì)譜技術(shù)鑒定了MRK B在MSK1上的磷酸化位點(diǎn), 其次,本文還篩選得到了人類蛋白質(zhì)MRK β與14-3-3 zeta

9、(WHAZ)的相互作用.利用上述方法本文也確定了二者之間的特異性相互作用.這對(duì)相互作用對(duì)于MRK B磷酸化MSKl的意義值得進(jìn)一步的深入研究. 另外,本文也驗(yàn)證了人類蛋白質(zhì)CCNH與CtBP2之間的相互作用并且分析了這對(duì)相互作用的未來(lái)研究意義。 生物信息學(xué)正處于急速發(fā)展上升的階段,已經(jīng)成為生命科學(xué)研究人員必不可少的工具和重要的方法,也成為了蛋白質(zhì)組學(xué)當(dāng)中不可或缺的重要組成部分,大量的試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析成為了生物研究者理解認(rèn)

10、識(shí)蛋白質(zhì)分類和功能的有力手段.結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)的基本組成部分,它具有三維的定義。首先,它應(yīng)該是一段具有序列保守性的蛋白質(zhì)序列(motif)；其次,它具有保守的結(jié)構(gòu)特征；再次,它具有保守的功能.對(duì)結(jié)構(gòu)域的研究和認(rèn)識(shí)是理解蛋白質(zhì)功能的主要方面。本文針對(duì)鏈霉菌噬菌體整合酶phiC31的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了預(yù)測(cè),并結(jié)合該整合酶的識(shí)別序列特征,預(yù)測(cè)了將該系統(tǒng)應(yīng)用于人類基因治療的風(fēng)險(xiǎn).本文也利用動(dòng)態(tài)規(guī)劃以及基于核方法的機(jī)器學(xué)習(xí)方法預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域,并且以網(wǎng)絡(luò)