酵母雙雜交篩選stratifin在結腸癌干細胞中相互作用的蛋白質.pdf

1、後旦大學碩士學位論文學校代碼：10246學號：10211280010(專業(yè)學位)酵母雙雜交篩選stratifin在結腸癌干細胞中相互作用的蛋白質ScreeningfortheproteinsinteractingwithStratifininhumancoloncancerstemcellsbyyeasttwohybridassays系：復旦大學附屬華東醫(yī)院業(yè)：臨床醫(yī)學(內科學)名：宓林師：于曉峰教授導師組成員：鄒健副主任完成日期：20

2、13年4月15Et院專姓導復旦大學碩士學位論文酵母雙雜交篩選stratifin在結腸癌干細胞中相互作用的蛋白質中文摘要背景我們在前期研究中通過比較親代結腸癌SWlll6細胞株和結腸癌干細胞株(SWlll6csc)之間的差異表達蛋白，發(fā)現(xiàn)其中Stratifin具有顯著差異。本次實驗進一步研究Stratifin在人結腸癌干細胞中相互作用的蛋白。材料方法人結腸癌干細胞株(SWlll6csc)是本課題組前期從SWlll6細胞株中分離出并傳代培養(yǎng)

3、。我們應用CLONTECH酵母雙雜交系統(tǒng)(MATCHMAKERGAL4TwoHybridSystem3)，提取SWll16csc中的細胞總RNA后進行反轉錄合成eDNA，轉化大腸桿菌DHIOB并構建eDNA初級文庫，與pGADT7進行重組形成AD質粒。將Stratifin基因利用經PCR引入的SfiI酶切位點定向克隆至pGBKT7，轉化大腸桿菌ToplO，構建BD質粒pGBKT7一SFN，并用卡那霉素篩選相應陽性克隆，通過酶切提取質粒鑒

4、定插入片段的大小。將序列正確的文庫質粒pGADT7一SWlll6csc及誘餌質粒pGBKT7SFN共同轉化至酵母菌株AHl09，檢測誘餌質粒有無毒性作用及自激活功能。通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選人結腸癌干細胞eDNA文庫中與Strafitin相互作用的蛋白，篩選出His3幾acZ／Ade2陽性轉化子并進行DNA測序和BLAST比對。實驗結果構建的pGADT7一SWI116csc文庫質粒經PCR擴增，檢測發(fā)現(xiàn)片段長度約15Kbp左右，pGBKT

5、7一SFN經SfiI酶切后產生1OKbp以上大小的片段，均與理論擴增大小一致。將酵母雙雜交系統(tǒng)中的重組誘餌載體pGBKT7一SFN與人結腸癌干細胞cDNA文庫質粒DNA共同轉化至酵母菌株AHl09，報告基因的檢測結果顯示其不具有毒性及自激活效應。利用酵母雙雜交的方法篩選出了7個與Stratifin蛋白相互作用的His3／LacZ／Ade2陽性轉化子，通過DNA測序和BLAST比對得共到了4種相關蛋白：BAD、MPRIP、CHRM】7、T