酵母雙雜交技術(shù)篩選與eIF5A相互作用蛋白質(zhì)及其功能研究.pdf

1、近年來(lái)研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),eIF5A還與細(xì)胞凋亡的發(fā)生密切相關(guān),但詳細(xì)機(jī)制并不清楚.我們實(shí)驗(yàn)室在阻斷泛素通路誘發(fā)白血病細(xì)胞凋亡的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中,發(fā)現(xiàn)eIF5A參與了上述凋亡調(diào)控,特別是抑制eIF5A的hypusine翻譯后修飾能夠誘發(fā)白血病細(xì)胞凋亡(靳寶鋒等.Oncogene,2003,22:4819-4830).該文為進(jìn)一步揭示eIF5A在細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用,應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)對(duì)eIF5A相互作用蛋白質(zhì)進(jìn)行了篩選并對(duì)其功能進(jìn)行了初步研

2、究.結(jié)果顯示,我們首次發(fā)現(xiàn)并系統(tǒng)證明了eIF5A與syntenin之間能夠發(fā)生特異性的相互作用,并具有重要的功能.在酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)中,我們分別以eIF5A的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域EFP(N末端)和eif5a(C末端)為誘鉺,在人類(lèi)乳腺文庫(kù)中篩選與其相互作用的蛋白質(zhì).在篩選出eIF5A的相互作用蛋白質(zhì)syntenin后,我們隨后從人類(lèi)乳腺文庫(kù)中釣取了其cDNA序列,為下一步的結(jié)構(gòu)和功能研究做好準(zhǔn)備.為進(jìn)一步確認(rèn)eIF5A與syntenin之間存在特異

3、性的蛋白質(zhì)相互作用,該文進(jìn)行了體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)(in vitro:GST pull-down)和體仙結(jié)合實(shí)驗(yàn)(in vivo:IP),并獲得了與酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)相一致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果.除此之外,該文還應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡的FRET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)技術(shù),在括細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證了eIF5A和syntenin存在特異性地相互作用.更進(jìn)一步,該文構(gòu)建了eIF5A和syntenin不同功能域缺失的系列突變體,揭示了eIF5A和syntenin發(fā)生相互作用的結(jié)合區(qū)

4、域.為確定eIF5A和syntenin相互作用的生物學(xué)意義,我們成功地在乳腺癌細(xì)胞T47D中建立了一套Sox4轉(zhuǎn)錄激活熒光報(bào)告測(cè)試系統(tǒng).Sox4已知在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起著重要的促進(jìn)作用.進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),eIF5A通過(guò)與syntenin相互作用,抑制了Sox4的轉(zhuǎn)錄激活活性.更進(jìn)一步,我們還在研究中首次發(fā)現(xiàn),eIF5A的過(guò)量表達(dá)可以引起p53蛋白質(zhì)的上調(diào)和激活,而syntenin通過(guò)與eIF5A結(jié)合能夠抑制eIF5A誘發(fā)的p53過(guò)