商陸組織培養(yǎng)及綠色熒光蛋白基因工程菌構(gòu)建.pdf

1、商陸（Ｐhytolaccaceae)為商陸科多年生草本植物，我國具有豐富的野生資源。商陸被廣泛用于醫(yī)藥、病蟲害防治、食品著色以及植物修復(fù)等方面。但是由于野生型商陸的生長周期比較長，而且商陸自身具有毒性，商陸的栽培和應(yīng)用受到很大的困擾。因此，開發(fā)商陸的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，從分子層面上來研究商陸，對我們更深入的研究商陸富集重金屬的機理及其與食品安全之間的關(guān)系，以及研究開發(fā)無毒或低毒、次生代謝產(chǎn)物高產(chǎn)植株、多種重金屬富集植株、速生等轉(zhuǎn)基因新品種具有

2、重要的意義。這將為我國商陸的進一步推廣應(yīng)用奠定一個良好的基礎(chǔ)。
　　 本研究對商陸種子快速萌發(fā)及無菌苗培養(yǎng)的條件、商陸高效再生體系的建立、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的GFP基因轉(zhuǎn)化商陸愈傷組織的參數(shù)及轉(zhuǎn)化腋芽原基的參數(shù)、轉(zhuǎn)化植株的篩選、轉(zhuǎn)化植株的鑒定等開展了系列研究，得出的主要結(jié)論如下：
　　 1、商陸種子萌發(fā)及無菌苗培養(yǎng)的最適條件為：商陸種子在酸性消毒液中處理15min，然后接種在MS+20g/L 蔗糖+7g/L 瓊脂培養(yǎng)基上，26±

3、1℃
　　 下暗培養(yǎng)1W，萌發(fā)率為96.7％，沒有污染現(xiàn)象。隨后，將光照強度調(diào)為1500LUX、光/暗周期12h/12h，2W 后可以成苗，成苗率100％。
　　 2、商陸高效再生體系的建立：我們以商陸的葉片、葉柄、莖段和莖節(jié)為外植體，以附加一定植物激素的MS 培養(yǎng)基為誘導(dǎo)愈傷組織和誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，以附加不同濃度的IBA的MS 培養(yǎng)基為生根培養(yǎng)基，建立了商陸高效再生體系。其中（1）愈傷組織誘導(dǎo)最佳激素配比為：葉片： 6-

4、BA 2.0 mg/L，IBA 0.4mg/L；莖段：6-BA 1.0 mg/L，IBA 0.2 mg/L；葉柄： 6-BA 1.0 mg/L，IBA 0.2 mg/L；在最適培養(yǎng)基上所有外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率都為100％。（2）莖節(jié)腋芽分化增殖最佳激素配比為6-BA 1.0 mg/L，IBA0.2mg/L；（3）最佳誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基為：1/2MS+IBA 0.2 mg/L+蔗糖 20 g/L+瓊脂 7.0 g/L；
　　 3、商

5、陸外植體對抗生素卡那霉素（Km）和潮霉素（Hyg）的敏感性不同，潮霉素50 mg/L 就可以完全抑制商陸外植體愈傷組織的產(chǎn)生和分化，而卡那霉素.則需要 100 mg/L；但分化芽的生根對卡那霉素和潮霉素都十分敏感，少量抗生素就可以完全抑制商陸分化芽的生根。
　　 4、以中間載體PBI121 為基礎(chǔ)，以EGFP 序列為目的片段插入DNA，構(gòu)建了在植物中可以表達的中間表達載體。通過PCR和酶切驗證，表明中間表達載體已經(jīng)構(gòu)建成功，并已