重組人心肌肌紅蛋白基因工程菌的構(gòu)建及重組蛋白的初步純化.pdf

1、肌紅蛋白(myoglobin，Mb)是與血紅蛋白相似的血紅素蛋白質(zhì)，是橫紋肌組織特有的色素蛋白，分子量為17KD。約占肌肉蛋白質(zhì)總量的0.1％～0.2％，其分子結(jié)構(gòu)和血紅蛋白的亞基相似，由1條多肽鏈和1個血紅素分子構(gòu)成。人的Mb肽鏈含153個氨基酸，其結(jié)構(gòu)排列與血紅蛋白的n鏈非常相似。 肌紅蛋白(Mb)用于心肌損傷檢測的生化標志物已近30年。目前仍普遍用作急性心肌梗死(AMI)的早期珍斷。AMI時，損傷的心肌細胞釋放Mb入血，在

2、癥狀發(fā)生后1～2h，血清Mb即異常升高。4～8h達最高值，72h后恢復(fù)至正常。心電圖(ECG)是早期診斷AMI的較可靠檢查方法。 長期的臨床實踐證實，如果將Mb與ECG同時應(yīng)用，可提高AMI早期診斷率。有研究結(jié)果表明，胸痛患者同時進行ECG檢查和Mb測定，AMI的診斷率可由單用ECG的62％提高到82％。 但是，目前臨床上應(yīng)用的Mb診斷試劑盒多為國外進口，價格昂貴，限制了Mb在臨床上早期診斷中的廣泛應(yīng)用。研制成功具有自主

3、知識產(chǎn)權(quán)，完全國產(chǎn)化的Mb診斷試劑盒是當前急需。在研究中發(fā)現(xiàn)試劑盒的重要組成成分Mb抗原的來源問題嚴重制約著Mb試劑盒的國產(chǎn)化進程。傳統(tǒng)的方法是從心肌組織中采用生化方法提取，但目前人心肌組織的來源極其困難，且質(zhì)量也難以保證，致使其產(chǎn)率極低，抗原活性也不理想。因此我們利用基因工程技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定、高效表達人肌紅蛋白的基因工程菌，獲得高純度的Mb，為今后開展Mb診斷試劑盒國產(chǎn)化研究奠定堅實的基礎(chǔ)。 本研究的目的是構(gòu)建穩(wěn)定、高效表達重組人

4、心肌肌紅蛋白的基因工程菌株，并初步純化重組蛋白以達到制備單克隆抗體的要求，為臨床檢測心肌損傷及預(yù)后提供診斷試劑材料，促進心肌肌紅蛋白診斷標準化的研究。 設(shè)計引物時將上下游引物的兩端分別插入NdeⅠ內(nèi)切酶位點和HindⅢ內(nèi)切酶位點，可使目的基因準確的插入pET21a(+)表達載體，并簡化了cDNA克隆階段的操作。 采用RT-PCR方法從人心肌組織總RNA中克隆出全長的人心肌肌紅蛋白基因，將其插入到pMD18-T simpl

5、e克隆載體中，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，經(jīng)酶切和測序?qū)δ康幕蚍治?，再插入到pET-21a(+)表達載體中，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，對誘導(dǎo)表達的目的蛋白行SDS-PAGE和采用銳普(R)心梗儀檢測重組蛋白的抗原性并準確定量。通過硫酸銨沉淀法以及透析法對重組蛋白進行初步純化，使其可以達到單克隆抗體制備所需的抗原純度。 克隆了全長的肌紅蛋白基因，目的蛋白表達量達菌體總蛋白的15％，重組蛋白抗原性良好，抗原純度為80％，達到制備單克