人臍血干細(xì)胞移植對(duì)兔股動(dòng)脈球囊損傷后內(nèi)膜修復(fù)和內(nèi)皮功能的影響.pdf

1、目的：糖尿病周圍血管病變的病理改變?yōu)閯?dòng)脈粥樣硬化，患者患病率高、發(fā)病年齡早、病情進(jìn)展快，常伴多器官同時(shí)受累較多。內(nèi)皮細(xì)胞受損是糖尿病血管病變的始動(dòng)因子之一，內(nèi)皮細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，通過(guò)復(fù)雜的機(jī)制調(diào)節(jié)管壁的通透性及血管張力，血管的形成和重塑亦受內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的影響。糖尿病下肢血管缺血性病變患者在應(yīng)用動(dòng)脈介入治療后，取得明顯療效，但是，由于介入治療引起的內(nèi)膜損傷也成為術(shù)后再狹窄的主要原因之一，如何預(yù)防介入治療后再狹窄成為亟待

2、解決的問(wèn)題。
　　本研究旨在：1通過(guò)球囊擴(kuò)張術(shù)制備兔后肢動(dòng)脈內(nèi)膜損傷模型，損傷動(dòng)脈內(nèi)膜局部行人臍血干細(xì)胞移植。2通過(guò)監(jiān)測(cè)移植前后血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、內(nèi)皮素（ET-1）、一氧化氮（NO）水平的變化，觀察人臍血干細(xì)胞(HUCBSC)移植對(duì)內(nèi)皮功能的影響。3通過(guò)損傷動(dòng)脈內(nèi)膜病理變化觀察人臍血干細(xì)胞移植對(duì)動(dòng)脈內(nèi)膜的修復(fù)作用，探討臍血干細(xì)胞移植對(duì)介入治療后再狹窄的預(yù)防作用。
　　方法：實(shí)驗(yàn)對(duì)象新西蘭大白兔18只，由河北醫(yī)科大

3、學(xué)第四醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，為清潔級(jí)，雄性，體重2.1±0.5Kg。隨機(jī)分為三組，每組6只，正常對(duì)照組（A組），只行兔左側(cè)股動(dòng)脈分離術(shù)；球囊損傷組（B組），單純行左側(cè)股動(dòng)脈球囊擴(kuò)張、牽拉，造成動(dòng)脈內(nèi)膜損傷；球囊損傷后人臍血干細(xì)胞移植組（C組），于球囊損傷左側(cè)股動(dòng)脈后行人臍血干細(xì)胞移植，同時(shí)A組和B組注射等量的PBS緩沖液作為對(duì)照，術(shù)畢均予縫合傷口，青霉素鈉(160萬(wàn)U/次，2次/日)肌肉注射抗感染，連用3d,肝素鈉注射液(200U/Kg

4、.d)連用3d。各組動(dòng)物于術(shù)前及干預(yù)后1周、4周采集外周血，用ELISA法測(cè)定VEGF的水平、ET-1的水平，血漿NO采用硝酸還原酶法測(cè)定；術(shù)后4周所有動(dòng)物處死前取左側(cè)股動(dòng)脈，行HE染色觀察內(nèi)膜修復(fù)情況。
　　1、人臍血干細(xì)胞(HUCBSC)的采集、分離、制備
　　人臍血來(lái)源于足月分娩健康產(chǎn)婦，采集新鮮臍血（6h內(nèi)用完），先用PBS液等倍數(shù)稀釋后放置于離心管（50ml）中，按1:1配比加入至人淋巴細(xì)胞分離液上，4℃保存，8c

5、m離心半徑，每分鐘2000轉(zhuǎn)，離心20分鐘后，臍血分成5層，單個(gè)核細(xì)胞在中間白膜層，此時(shí)用移液器在中間白膜層小心吸取含單個(gè)核細(xì)胞的混懸液，放入另一個(gè)離心管中，4℃,8cm離心半徑，每分鐘1000轉(zhuǎn)，離心15分鐘，PBS液洗滌3次。最后用低糖DMEM培養(yǎng)液懸浮，細(xì)胞濃度計(jì)數(shù)為5×105/ml.人臍血干細(xì)胞混懸液采集、分離、制備成功。
　　2、兔股動(dòng)脈球囊損傷模型制備
　　從兔耳緣靜脈注入3％戊巴比妥鈉2ml/kg麻醉,術(shù)中肝素

6、200u/kg抗凝,于左側(cè)腹股溝韌帶至膝關(guān)節(jié)上下縱行切開(kāi)，分離左側(cè)股動(dòng)脈，夾閉近端、遠(yuǎn)端血管，于近心端進(jìn)行股動(dòng)脈穿刺，A組：僅行左側(cè)后肢股動(dòng)脈分離術(shù)；B組、C組行股動(dòng)脈穿刺后把3.0-40mm球囊緩慢送入至股動(dòng)脈，給12個(gè)大氣壓充盈球囊，保持3分鐘，間歇1分鐘后重復(fù)上述操作，共操作3次，同時(shí)牽拉球囊，以制成兔左后肢股動(dòng)脈球囊損傷模型。
　　3、球囊損傷后人臍血干細(xì)胞移植術(shù)
　　B、C兩組球囊損傷兔左后肢股動(dòng)脈模型制備成功后，

7、恢復(fù)股動(dòng)脈血流3分鐘，夾閉A、B、C三組分離的股動(dòng)脈遠(yuǎn)端，A、B組于夾閉股動(dòng)脈近端處注入0.5mlPBS緩沖液，C組在夾閉股動(dòng)脈近端處注入已制備好的人臍血干細(xì)胞混懸液0.5ml。注射完畢后，三組分離的股動(dòng)脈近端均用血管夾夾閉30分鐘，讓移植的干細(xì)胞充分歸巢，手術(shù)縫合傷口，使股動(dòng)脈恢復(fù)血流。肝素（200U/kg.d），抗凝3天。
　　4、移植前后血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、內(nèi)皮素（ET-1）、一氧化氮（NO）水平的測(cè)定
　　

8、A、B、C三組術(shù)前、術(shù)后1周、術(shù)后4周均采外周血5ml,枸櫞酸鈉抗凝，分離血漿備用。VEGF、ET-1測(cè)定采用ELISA法，單位：μg/L。血漿一氧化氮（NO）測(cè)定采用硝酸還原酶法測(cè)定，單位：umol/L。
　　5、損傷血管內(nèi)膜修復(fù)的觀察
　　移植后4周，常規(guī)方法制備兔損傷血管光鏡組織切片，行蘇木素-伊紅（HE）染色,采集圖像，觀察損傷血管內(nèi)膜修復(fù)情況。
　　應(yīng)用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以x±s

9、表示，組間、組內(nèi)比較采用方差分析(F檢驗(yàn))，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物觀察 A、B、C三組動(dòng)物術(shù)后傷口逐漸愈合，無(wú)糜爛潰瘍，活動(dòng)能力正常，所有動(dòng)物在處死取材時(shí)，局部均無(wú)壞疽，所有動(dòng)物中途無(wú)因故退出。
　　2、 VEGF水平測(cè)定結(jié)果術(shù)前，A、B、C三組VEGF水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；術(shù)后1周，C組VEGF水平升高，高于B組和A組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），B組VEGF水平

10、高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；術(shù)后4周，C組VEGF水平仍高于B組和A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），B組VEGF水平高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。A組組內(nèi)VEGF水平術(shù)前、術(shù)后1周、術(shù)后4周差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；B組組內(nèi)VEGF水平術(shù)后4周高于術(shù)前、術(shù)后1周，術(shù)后1周高于術(shù)前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；C組組內(nèi)VEGF水平術(shù)后1周高于術(shù)前、術(shù)后4周，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）

11、，術(shù)后4周高于術(shù)前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　3、 ET-1和血漿NO水平的變化 A、B、C三組術(shù)前ET-1水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；術(shù)后1周，C組ET-1水平低于A、B兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），B組ET-1水平低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；術(shù)后4周C組ET-1水平均低于于A、B兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），B組ET-1水平低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

12、A組組內(nèi)ET-1水平術(shù)前、術(shù)后1周、術(shù)后4周差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；B組組內(nèi)ET-1水平術(shù)前、術(shù)后1周、術(shù)后4周兩兩比較均有差異（P<0.05）；C組組內(nèi)ET-1水平術(shù)前與術(shù)后4周無(wú)差異，術(shù)后4周低于術(shù)后1周，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。A、B、C三組術(shù)前NO水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；術(shù)后1周，C組NO水平高于A、B兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05），A、B兩組NO水平差異不顯著；術(shù)后4周，C組NO水平高

13、于A、B兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），A、B兩組NO水平差異不顯著。C組術(shù)后4周較術(shù)前、術(shù)后1周均有升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。A組組內(nèi)NO水平術(shù)前、術(shù)后1周、術(shù)后4周差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05）；B組組內(nèi)NO水平術(shù)前高于術(shù)后1周、術(shù)后4周，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05），術(shù)后1周NO水平高于術(shù)后4周，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05）；C組組內(nèi)NO水平術(shù)后4周較術(shù)前、術(shù)后1周均有升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0

14、.05），術(shù)前高于術(shù)后1周，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　4、股動(dòng)脈內(nèi)膜修復(fù)的觀察術(shù)后4周，C組動(dòng)物股動(dòng)脈有輕度內(nèi)膜中斷和增生，彈力膜輕度斷裂， B組動(dòng)物股動(dòng)脈內(nèi)膜連續(xù)性中斷，內(nèi)膜增生明顯，彈力膜斷裂明顯；A組動(dòng)物股動(dòng)脈內(nèi)膜完整，彈力膜連續(xù)，無(wú)斷裂。
　　結(jié)論：
　　1、本實(shí)驗(yàn)通過(guò)球囊擴(kuò)張并阻斷血流建立兔左后肢股動(dòng)脈缺血損傷模型。
　　2、人臍血干細(xì)胞移植可能促進(jìn)兔模型血清VEGF分泌，誘導(dǎo)血管形成，增