人卵黃囊內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)臍血造血干-祖細(xì)胞擴(kuò)增的研究.pdf

1、目的：臍血造血干/祖細(xì)胞(hematopoietic stem/progenitor。cells,HS/PCs)體外擴(kuò)增是解決造血干細(xì)胞移植供者來(lái)源困難的有效方法之一,也是造血干細(xì)胞移植研究的熱點(diǎn)。目前,體外擴(kuò)增造血細(xì)胞的方法主要有細(xì)胞因子擴(kuò)增和飼養(yǎng)層細(xì)胞擴(kuò)增。本研究從4-5周人卵黃囊中培養(yǎng)出內(nèi)皮細(xì)胞,聯(lián)合細(xì)胞因子對(duì)臍血造血干/祖細(xì)胞的體外擴(kuò)增作用進(jìn)行研究,并對(duì)其擴(kuò)增機(jī)制進(jìn)行初步探討。 方法：在中南大學(xué)倫理委員會(huì)指導(dǎo)下,

2、病人獲得知情同意后,獲取4-5周妊囊,從卵黃囊中分離純化內(nèi)皮樣細(xì)胞,免疫化學(xué)法檢測(cè)其內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗原的表達(dá)。利用該內(nèi)皮細(xì)胞聯(lián)合細(xì)胞因子,分3組體外擴(kuò)增臍血CD34<'+>細(xì)胞:①因子組:CD34<'+>細(xì)胞2×10<'4>個(gè)/m1+擴(kuò)增培養(yǎng)基;②非接觸培養(yǎng)組:CD34<'+>細(xì)胞2×10<'4>個(gè)/ml+擴(kuò)增培養(yǎng)基+millicell膜+人卵黃囊內(nèi)皮細(xì)胞;③接觸培養(yǎng)組:CD34<'+>細(xì)胞2×10<'4>個(gè)/m1+擴(kuò)增培養(yǎng)基+人卵黃囊

3、內(nèi)皮細(xì)胞,每組復(fù)4孔接種于24孔板。體外培養(yǎng)7天后,從細(xì)胞總數(shù),CD34<'+>細(xì)胞數(shù),高增殖潛能集落形成細(xì)胞數(shù)和紅系/粒單系集落數(shù)方面比較各組的擴(kuò)增效率。利用RT-PCR檢測(cè)Notch信號(hào)通路在人卵黃囊內(nèi)皮細(xì)胞和擴(kuò)增的造血細(xì)胞的表達(dá)。 結(jié)果： 一.從4-5周人卵黃囊中培養(yǎng)出的內(nèi)皮樣細(xì)胞具有典型內(nèi)皮細(xì)胞的特點(diǎn) 卵黃囊細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后,部分細(xì)胞貼壁,3-4天后形成由40一50個(gè)大小均一細(xì)胞組成的集

4、落,呈多角形,單層鋪路石樣排列。機(jī)械方法傳代后的細(xì)胞能再次形成均一的集落。生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞能形成條索樣結(jié)構(gòu),在Matrigel上能形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。取第3代人卵黃囊內(nèi)皮細(xì)胞檢測(cè),CD31為強(qiáng)陽(yáng)性,vWF和VE-Cadherin(CD144)為陽(yáng)性。對(duì)照的人骨髓成纖維細(xì)胞上述抗原均為陰性。因此,來(lái)源于4-5周人卵黃囊的內(nèi)皮樣細(xì)胞符合典型的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài),并表達(dá)成熟內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗原CD31、vWF和CD144。 二.與人卵黃囊內(nèi)皮細(xì)胞

5、接觸培養(yǎng)能明顯促進(jìn)臍血中高增殖潛能集落形成細(xì)胞(high potential proliferation-colony forming cells,HPP-CFCs)的擴(kuò)增 流式細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示,接觸培養(yǎng)組中的細(xì)胞總數(shù)擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)52.35±7.28倍,明顯高于因子組24.08±4.31倍(P<0.05)和非接觸培養(yǎng)組25.75±4.02倍(P<0.05),三組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 CD34<'+

6、>細(xì)胞數(shù)接觸培養(yǎng)組擴(kuò)增7.58±1.08倍，因子組擴(kuò)增4.61±0.68倍，非接觸培養(yǎng)組擴(kuò)增4.39±1.12倍，三組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高增殖潛能集落形成細(xì)胞檢測(cè)的結(jié)果顯示，三組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，HPP-CFC的擴(kuò)增倍數(shù)以接觸培養(yǎng)組為最高，達(dá)20.26±1.87倍，明顯高于因子組5.31±1.83倍(P<0.05)和非接觸培養(yǎng)組6.36±2.53倍(P<0.05)。這說(shuō)明與人卵黃囊內(nèi)皮細(xì)胞接觸培養(yǎng)能促進(jìn)臍血造血干／

7、祖細(xì)胞的擴(kuò)增，尤其是高增殖潛能集落形成細(xì)胞的擴(kuò)增。 三、與人卵黃囊內(nèi)皮細(xì)胞接觸培養(yǎng)能明顯促進(jìn)臍血早期紅系祖細(xì)胞(erythroid burst-forming units，BFU-E)的擴(kuò)增 接觸培養(yǎng)組早期紅系祖細(xì)胞BFU-E擴(kuò)增27.77±5.77倍，明顯強(qiáng)于因子組7.14±0.99倍(P<0.05)和非接觸培養(yǎng)組11.02±3.31倍(P<0.05)，三組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；晚期紅系祖細(xì)胞CFU-E

8、接觸培養(yǎng)組擴(kuò)增17.19±4.27倍，因子組擴(kuò)增7.93±2.74倍，非接觸培養(yǎng)組擴(kuò)增9.12±1.49倍，三組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CFU-GM接觸培養(yǎng)組擴(kuò)增17.14±4.04倍強(qiáng)于因子組6.67±1.13倍和非接觸培養(yǎng)組10.51±0.89倍，但三組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說(shuō)明與人卵黃囊內(nèi)皮細(xì)胞接觸培養(yǎng)能促進(jìn)臍血早期紅系祖細(xì)胞BFU-E的擴(kuò)增。 四、Notch受體和配體mRNA在臍穩(wěn)血CD34<'+>細(xì)胞和人卵黃囊內(nèi)皮細(xì)胞的表

9、達(dá) 利用RT-PCR檢測(cè)Notch受體和配體mRNA的表達(dá)情況，臍血CD34<'+>細(xì)胞表達(dá)Notch受體Notchl，Notch2：未與臍血CD34<'+>細(xì)胞接觸培養(yǎng)的人卵黃囊內(nèi)皮細(xì)胞不表達(dá)Notch的配體Jaggedl，Jagged2，Deltal，DeIta4，但與臍血CD34<'+>細(xì)胞接觸培養(yǎng)7天后的人卵黃囊內(nèi)皮細(xì)胞能表達(dá)Notch的配體Jagged2，Deltal和Delta4。 結(jié)論： (1)從4

10、-5周人卵黃囊中培養(yǎng)出的內(nèi)皮細(xì)胞符合典型的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)，能自發(fā)形成線(xiàn)性結(jié)構(gòu)，在Matrigel上能形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并表達(dá)成熟內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)抗原CD31、CDl44和vWF。 (2)首次報(bào)道人卵黃囊內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)增臍血造血干／祖細(xì)胞的擴(kuò)增體系——人卵黃囊內(nèi)皮細(xì)胞聯(lián)合細(xì)胞因子IL-3、IL-6、SCF和GM-CSF，與臍血CD34<'+>細(xì)胞接觸培養(yǎng)，能促進(jìn)臍血造血細(xì)胞體外擴(kuò)增，尤其是代表原始造血細(xì)胞的高增殖潛能集落形成細(xì)胞(HPP-CFC

11、)和早期紅系祖細(xì)胞(BFU-E)有顯著擴(kuò)增。 (3)與臍血CD34<'+>細(xì)胞接觸培養(yǎng)7天后的人卵黃囊內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)Notch的配體Jagged2，Deltal和Delta4，和臍血CD34<'+>細(xì)胞表達(dá)的Notch受體Notchl，2結(jié)合啟動(dòng)Notch信號(hào)，這可能是人卵黃囊內(nèi)皮細(xì)胞與臍血CD34<'+>細(xì)胞接觸培養(yǎng)明顯促進(jìn)臍血原始造血細(xì)胞的高增殖潛能集落形成細(xì)胞(HPP-CFC)和原始的紅細(xì)胞系祖細(xì)胞(BFU-E)體外擴(kuò)增的原