轉(zhuǎn)THPO和FL膜外區(qū)基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對臍血造血干-祖細(xì)胞的體外擴(kuò)增研究.pdf

1、造血干細(xì)胞(HSCs)是指那些具有自我更新能力并能分化為所有血系細(xì)胞的干細(xì)胞。造血干細(xì)胞移植(HSCT)常被用來治療血液系統(tǒng)疾病和作為血液系統(tǒng)惡性疾病高劑量化療后的支持治療。骨髓、外周血和臍帶血是人類的主要造血干細(xì)胞源。由于臍帶血中含有比骨髓和外周血更高比例的原始造血干細(xì)胞，目前認(rèn)為臍帶血是比骨髓和細(xì)胞因子動員的外周血更有前途的造血干細(xì)胞源。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)接受臍帶血移植的病人的移植物抗宿主病(GVHD)的頻率明顯減小。單份臍帶血中的造血干

2、細(xì)胞對于重建兒童和體重較輕的成人的造血系統(tǒng)是足夠的，但是，對于體重較大的成年人是不夠的。為了解決這個(gè)問題，必須對臍帶血造血干細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增。本研究利用基因工程技術(shù)發(fā)展了一種獨(dú)特的轉(zhuǎn)雙基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并利用該轉(zhuǎn)基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合細(xì)胞因子對臍帶血造血干細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是來源于中胚層的具有很強(qiáng)的自我更新和多向分化能力的干細(xì)胞。本研究成功地分離純化了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并研究了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

3、的體外生長特性。這些骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在表型上呈典型的梭形纖維狀，原代培養(yǎng)時(shí)間大約為14d。生長動力學(xué)分析表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞呈典型的“S”型生長曲線。傳代培養(yǎng)后細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，P2-P20代之間每代持續(xù)時(shí)間大約為6d；但P20-P30代之間細(xì)胞活力下降，每代持續(xù)時(shí)間大約為9d。在200d的培養(yǎng)期內(nèi)，群體倍增時(shí)間在30-59h之間。在1-125d的培養(yǎng)期內(nèi)，群體倍增時(shí)間緩慢維持在30-40h之間；在125-200d的培養(yǎng)期內(nèi)，群體倍增

4、時(shí)間急速從40h上升到59h。81.5％的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞處于G0/G1期，呈典型的干細(xì)胞特性。流式細(xì)胞術(shù)分析表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原CD166、CD29和CD44為陽性，CD45、CD34和HLA-DR為陰性。 血小板生成素(THPO)和Flt-3配體(FL)是兩個(gè)重要的早期造血刺激因子。本研究利用RT-PCR技術(shù)成功地從含有高豐度THPO和FLmRNA的胎肝細(xì)胞中克隆了THPO和FL膜外區(qū)基因。序列分析表明，THPO基

5、因除了在蛋白信號肽序列中有一個(gè)堿基與Genebank中序列不同外，其他序列一致；FL膜外區(qū)序列與Genebank中序列完全一致。為了將THPO和FL膜外區(qū)基因?qū)牍撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞，我們利用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列(IRES)構(gòu)建了雙順反子共表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXPFIT。利用前刺激+離心沉淀+多輪轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染方法將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXPFIT導(dǎo)入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。RT-PCR和westernblotting分析表明，轉(zhuǎn)基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

6、中THPO和FL膜外區(qū)mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)分析證明在8代的轉(zhuǎn)基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)期內(nèi)THPO和FL膜外區(qū)蛋白能穩(wěn)定有效地分泌表達(dá)。另外，轉(zhuǎn)EGFP骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能在12代的培養(yǎng)期內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)EGFP熒光。這些結(jié)果表明，THPO和FL膜外區(qū)基因已經(jīng)成功地導(dǎo)入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定高效的蛋白表達(dá)。 進(jìn)一步我們研究了轉(zhuǎn)基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是否能有效支持臍帶血造血

7、干細(xì)胞的體外擴(kuò)增。第一階段(2wk)的含血清培養(yǎng)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合干細(xì)胞因子(SCF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-3(IL-3)能分別擴(kuò)增有核細(xì)胞總數(shù)、CD34+細(xì)胞、CFU-Cs和CFU-GEMM達(dá)910、121、62和90倍，明顯高于其他對照組的擴(kuò)增倍數(shù)。盡管2wk的無血清培養(yǎng)對有核細(xì)胞總數(shù)、CD34+細(xì)胞和CFU-Cs的擴(kuò)增倍數(shù)比含血清培養(yǎng)有所下降，但在兩種培養(yǎng)條件下CFU-GEMM的擴(kuò)

8、增倍數(shù)差異不顯著。為了研究轉(zhuǎn)基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是否能支持成鵝卵石樣造血干細(xì)胞(CAFC)的長期活性，我們進(jìn)行了第二階段(6wk)的擴(kuò)增培養(yǎng)。結(jié)果表明，在0-4wk的擴(kuò)增期內(nèi)，盡管轉(zhuǎn)基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體系對有核細(xì)胞總數(shù)、CD34+細(xì)胞、CFU-Cs和CFU-GEMM的擴(kuò)增明顯高于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體系，但是兩個(gè)培養(yǎng)體系對所有四個(gè)指標(biāo)的擴(kuò)增都呈相似的下降趨勢。可是，在4-6wk的擴(kuò)增期內(nèi)，原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體系不能有效地支持造血干細(xì)胞擴(kuò)

9、增，而我們建立的轉(zhuǎn)基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體系能有效地支持成鵝卵石樣造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增。 為了研究轉(zhuǎn)基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是否能有效支持臍帶血中更為原始的造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增，我們測定了體外長期培養(yǎng)起始細(xì)胞(LTC-ICs)和體內(nèi)SCID-小鼠體內(nèi)增殖的人造血干細(xì)胞(SRC)的擴(kuò)增。我們首先利用有限稀釋法精確測定了擴(kuò)增后造血細(xì)胞中LTC-ICs的頻率。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體系能分別在2wk和4wk的擴(kuò)增期內(nèi)有效擴(kuò)增LTC

10、-ICs達(dá)10和25倍，明顯高于其他培養(yǎng)體系。SRC實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，移植了轉(zhuǎn)基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體系擴(kuò)增4wk后的造血細(xì)胞的NOD/SCID小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞中人CD45+細(xì)胞的比例可達(dá)54-60％，間接證明SRC得到了有效的擴(kuò)增。進(jìn)一步的多系造血免疫分析結(jié)果表明，無論髓系的紅系表面抗原(血型糖蛋白A，GlyA)、粒系的特異表面抗原(CD33)、單核系的表面抗原(CD14)、巨核系的表面抗原(CD41)和粒巨核系表面標(biāo)志(CD34)，還