DAPT對結腸癌細胞株HT-29中Notch4、DLL1及ALDH1的影響.pdf

1、目的：本課題旨在研究Notch信號通路阻斷劑γ-分泌酶抑制劑（GSIs）DAPT作用于結腸癌細胞株HT-29后，初步探索Notch信號通路中受體Notch4、配體DLL1與結直腸癌腫瘤干細胞標記物ALDH1在細胞中的表達情況及相關性，為結直腸癌的防治提供理論依據(jù)。
　　方法：本次實驗的研究對象為結腸癌HT-29細胞株。首先在條件為37℃，20％O2,5%CO2和95%濕度的培養(yǎng)箱中，體外培養(yǎng)HT-29細胞，提取對數(shù)生長期細胞，分別

2、用于以下各步試驗。(1)用細胞免疫組化檢測HT-29細胞中ALDH1、Notch4及DLL1表達的情況及不同濃度DAPT對HT-29細胞中ALDH1、Notch4及DLL1表達的影響,圖像分析系統(tǒng)計量。(2)不同DAPT濃度（0、5、10、20、40、80μmol/L）作用于結直腸癌HT-29細胞，倒置顯微鏡下觀察不同濃度DAPT對HT-29細胞形態(tài)影響；用MTT比色法檢測不同濃度DAPT對HT-29細胞增殖的抑制作用。(3)運用rea

3、l-time PCR技術、Western-Blot技術檢測DAPT作用HT-29細胞前后，ALDH1、Notch4及DLL1的mRNA和蛋白質(zhì)的表達變化及相關性。
　　結果：(1)細胞免疫組化檢測結果顯示ALDH1、Notch4、DLL1在HT-29細胞中均有表達，當加入 DAPT后，與對照組相比 ALDH1、Notch4、DLL1蛋白表達降低（P<0.05），且隨著DAPT濃度的增加降低更明顯，存在濃度依賴性。
　　(2)

4、不同DAPT終濃度（0、5、10、20、40、80μmol/L）作用于結腸癌HT-29細胞，顯微鏡下觀察HT-29細胞具有典型的凋亡細胞形態(tài)學特征。MTT法檢測各濃度組分別與對照組相比較，對HT-29細胞的生長抑制率：24h細胞生長抑制率分別為0%、0.22%、5.85%、11.41%、13.82%、18.59%；48h分別為0%、6.06%、16.8%、25.44%、44.25%、56.73%；72h分別為0%、6.9%、4.86%、

5、27.6%、51.59%、67.78%。隨著DAPT作用濃度和時間的增加，其對HT-29細胞增殖抑制率顯著增大，實驗組與對照組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，呈時間和劑量依賴性。濃度為40、80μmol/L的DAPT在48h、72h分別與24h比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　(3)20、40μmol/LDAPT作用HT-29細胞48小時后，ALDH1、Notch4及DLL1的mRNA和蛋白的表達情況及相關性：在 H

6、T-29細胞中 ALDH1表達在 Notch4和DLL1表達下調(diào)時也下調(diào)(P<0.05），且ALDH1、Notch4及DLL1的蛋白表達在藥物濃度20與40μmol/L之間比較也有統(tǒng)計學意義(P<0.05）。ALDH1mRNA與Notch4mRNA表達有關（P<0.05）；Notch4mRNA與DLL1mRNA表達有關（P<0.05）；ALDH1mRNA與DLL1mRNA表達無關（P<0.05）。ALDH1與Notch4的蛋白表達有關（

7、P<0.05）；Notch4與DLL1的蛋白表達有關（P<0.05）；ALDH1與DLL1的蛋白表達無關（p>0.05）；可見，ALDH1、Notch4及DLL1的mRNA和蛋白表達差異的統(tǒng)計學意義一致，三者之間可能存在相關性。
　　結論：(1)Notch4、DLL1和ALDH1在人的結腸癌HT-29細胞中均有表達。
　　(2)DAPT能抑制結腸癌細胞HT-29的體外增殖，這種抑制作用在一定范圍內(nèi)具有時間和濃度的依賴性。