大花旋覆花內酯抑制HT-29結腸癌細胞株增殖及其機制研究.pdf

1、大花旋覆花內酯(ABL)是從歐亞旋覆花中提取的活性單體,具有抗炎和抑制血管平滑肌細胞增殖及新生內膜形成的功效,對乳腺癌、卵巢癌等腫瘤細胞株具有促凋亡作用。但ABL是否對結腸癌具有抑制作用尚不清楚?；谘装Y是導致結腸癌發(fā)生發(fā)展的病理機制之一,本研究觀察了ABL對HT-29結腸癌細胞株增殖和細胞周期的干預作用,并對其分子機制進行了探討,為ABL在結腸癌治療方面的應用提供了新的實驗依據(jù)。
　　 方法和結果:
　　 1 ABL抑

2、制HT-29細胞增殖
　　 將處于對數(shù)生長期的HT-29細胞接種于96孔板中,分別加入不同濃度ABL作用24 h后,用MTT法檢測細胞增殖活性。結果顯示,隨著ABL濃度增加,HT-29細胞增殖活力不斷下降,ABL的抗增殖作用具有劑量依賴性。與對照組相比,不同濃度ABL(0、50、100、150、200μmol/L)處理的HT-29細胞的增殖活力分別下降了21％、38％、49％和61％。
　　 在相同處理條件下,用細胞計數(shù)

3、檢測增殖活性,發(fā)現(xiàn)隨著ABL濃度的增加,HT-29細胞數(shù)量不斷降低,與對照組相比,分別減少了40％、52％、64％、76％和84％,與MTT分析結果一致,表明ABL能夠劑量依賴性地抑制HT-29細胞的增殖。
　　 2 ABL對HT-29細胞周期的阻滯作用
　　 將ABL處理后的HT-29細胞制備成單細胞懸液,預冷的70％乙醇4℃固定過夜。加熒光染料后,過濾,用流式細胞儀檢測細胞周期分布情況。結果顯示,不同濃度ABL(50

4、、100、150、200μmol/L)作用HT-29細胞24h后,可使處于S期的細胞數(shù)顯著減少,而G0/G1期的細胞數(shù)增加,較對照組分別增加了3％、12％、19％和24％,表明ABL能夠劑量依賴性地抑制HT-29細胞周期進程。
　　 3 ABL抑制HT-29細胞cyclinE和CDK4的表達,上調p21的表達用不同濃度ABL(0、50、100、150、200μmol/L)處理HT-29細胞24h后,用Western blot檢測

5、細胞周期相關蛋白的表達情況。結果顯示,ABL可劑量依賴性地抑制cyclinE和CDK4的表達(P＜0.05),與此同時,p21的表達量逐漸升高,分別是對照組的1.16、1.43、1.53和1.59倍,提示ABL阻滯HT-29細胞周期進程與抑制cyclinE、CDK4表達及上調p21表達有關。
　　 4 ABL誘導HT-29細胞KLF4的表達
　　 Krüppel樣因子4(Krüppel-like factor,KLF4)

6、是一種含鋅指結構的轉錄因子家族成員,主要參與調節(jié)細胞發(fā)育、分化、增殖和凋亡等過程,在胃腸道上皮細胞中含量豐富,在結腸癌的病理發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。Western blot結果顯示,ABL可誘導HT-29細胞表達KLF4,與未處理的對照細胞比較,ABL處理24h后,KLF4表達水平分別是對照組的1.04、1.19、1.25和1.56倍。細胞免疫熒光染色結果顯示,KLF4主要存在于HT-29細胞胞漿中,給予ABL(200μmol/L)刺激

7、24h后,胞漿中KLF4含量明顯增多。
　　 5 KLF4抑制HT-29細胞增殖
　　 為了確定ABL誘導KLF4表達與其抑制增殖之間的關系及藥理意義,進而用重組腺病毒pAd-KLF4感染細胞48h進行MTT分析。結果顯示,KLF4的過表達能夠抑制HT-29細胞增殖,其抑制效應與感染病毒量(0、20、30、40和50μl/ml)呈正相關,提示JLF4參與介導ABL的抗增殖效應。
　　 6 KLF4抑制HT-29細

8、胞中cyclinE和CDK4的表達,上調p21的表達
　　 為了揭示KLF4介導ABL抗增殖的機制,本研究觀察了過表達KLF4對細胞周期相關蛋白表達的影響,Western blot分析發(fā)現(xiàn)與對照組相比,過表達KLF4的細胞中cyclinE和CDK4表達分別下降了51％和40％,而p21的表達水平是升高的。這些數(shù)據(jù)表明,過表達KLF4可引發(fā)與ABL相似的抗腫瘤效應,表明ABL是通過激活KLF4而阻滯細胞周期進程和抑制HT-29細胞