高山離子芥線粒體交替途徑介導(dǎo)的抗寒特征研究.pdf

1、高山離子芥是一種典型的高海拔寒區(qū)適應(yīng)性物種，生長于海拔3800米以上的冰緣地帶，整個(gè)生活周期受到寒冷，強(qiáng)紫外輻射和低氧分壓的影響。高山離子芥不具備特殊的形態(tài)學(xué)特征來抵御寒冷脅迫，體內(nèi)細(xì)胞活動承擔(dān)了主要的防御能力。線粒體是一個(gè)重要的產(chǎn)能細(xì)胞器，植物線粒體具有多種交替途徑所介導(dǎo)的能量耗散系統(tǒng)，主要包括末端交替氧化酶途徑，解偶聯(lián)途徑和交替NAD(P)H脫氫酶途徑。雖然已經(jīng)有很多的研究發(fā)現(xiàn)這些途徑參與了植物的抗逆過程，但是對于高山離子芥的相關(guān)研

2、究尚屬空白。本論文以高山離子芥為材料，研究了冷脅迫時(shí)的植物線粒體抗性特征及線粒體交替途徑在抗寒中的作用特征。同時(shí)，研究了參與植物線粒體交替型NAD(P)H脫氫途徑的蛋白質(zhì)之間的相互作用與抗寒性的關(guān)系，從而深入了解該途徑在植物抗寒中的作用機(jī)制。取得了以下研究結(jié)果： 1．采用HPLC對高山離子芥懸浮細(xì)胞的泛醌氧化還原性水平在不同溫度處理下的變化進(jìn)行了研究。結(jié)果表明早期低溫誘導(dǎo)下，細(xì)胞活性氧水平和線粒體功能保持正常，泛醌的氧化還原狀態(tài)

3、之間的轉(zhuǎn)變加劇，氧化性水平升高，這種氧化還原轉(zhuǎn)變使得泛醌發(fā)揮了其抗氧化活性，在高山離子芥細(xì)胞受到早期低溫脅迫誘導(dǎo)時(shí)可以降低隨之產(chǎn)生的活性氧的積累。 2．Western-blotting研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高山離子芥不具備類似于其它植物的電子傳遞鏈末端交替氧化酶，KCN對細(xì)胞色素氧化酶的抑制使線粒體的呼吸耗氧完全受到抑制，而交替氧化酶抑制劑SHAM對呼吸功能沒有影響。盡管抗體檢測發(fā)現(xiàn)了線粒體解偶聯(lián)蛋白(UCP)的存在，但它對增強(qiáng)高山離子

4、芥的抗寒能力貢獻(xiàn)不大，低溫誘導(dǎo)并不會引起UCP蛋白的積累。因此，高山離子芥線粒體具有特殊的能量耗散體系。 3．質(zhì)膜14-3-3蛋白在受到低溫誘導(dǎo)時(shí)積累增加，表明高山離子芥跨質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)能力增強(qiáng)，但是，隨著低溫強(qiáng)度的升高此調(diào)節(jié)作用受到限制。低溫誘導(dǎo)引起了線粒體NAD(P)H氧化功能的顯著升高，這種增強(qiáng)的NAD(P)H氧化途徑對魚藤酮的敏感性很低，表現(xiàn)為交替型NAD(P)H脫氫酶(AtNDH)特征，這條交替途徑介導(dǎo)了重要的抗寒途徑。

5、 4．利用Native-PAGE和Gel-filtration，從高山離子芥線粒體中分離得到一個(gè)具有催化NADH: quinone氧化還原功能的脫氫酶復(fù)合體。該復(fù)合體由5個(gè)亞基組成，催化NADH脫氫不受魚藤酮抑制，選擇性的以泛醌類似物CoQ<,0>為電子受體，其中58kD亞基為催化亞基，以黃素腺苷二磷酸(FAD)作為輔酶，western-blotting研究發(fā)現(xiàn)該催化亞基為硫辛酸脫氫酶2(LPD<,2>)；26kD亞基為一個(gè)小分

6、子伴侶蛋白sHsp，和LPD<,2>發(fā)生直接的相互作用。因此，LPD<,2>在高山離子芥線粒體中以復(fù)合體形式存在，行使類似AtNDH催化功能，小分子伴侶蛋白sHsp可以穩(wěn)定復(fù)合體組裝，保證酶活性即使在低溫脅迫條件下也免受損傷。 5．利用Native-PAGE從擬南芥線粒體中分離得到了一個(gè)類似于高山離子芥LPD脫氫酶的復(fù)合體，此復(fù)合體由5個(gè)亞基組成，催化NAD(P)H：quinone氧化還原反應(yīng)，高選擇性的以CoQ<,0>作為電子

7、受體，并且以NADPH作為底物時(shí)的反應(yīng)速率高于對NADH的催化速率。MOLDI-ToF鑒定發(fā)現(xiàn)LPD<,2>和N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸還原酶(NAGPR)分別催化NADH和NADPH的脫氫，另外3個(gè)亞基分別為：蘋果酸脫氫酶(MDH)，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AAT)和分子伴侶Cpn20。 6．利用免疫共沉淀技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證擬南芥NAD(P)H：quinone復(fù)合體各亞基之間的相互作用，對其組裝及作用機(jī)理進(jìn)行研究。NAGPR抗體免疫沉淀研究

8、發(fā)現(xiàn)， LPD，MDH和Cpn20可以得到共純化，表明這些蛋白質(zhì)確實(shí)可以通過相互之間作用形成復(fù)合體。細(xì)胞免疫熒光共定位則進(jìn)一步證實(shí)了這些亞基在體內(nèi)也存在類似的相互作用。因此通過蛋白質(zhì)相互作用可以得到該復(fù)合體的作用機(jī)制：線粒體NADH:quinone氧化還原和蘋果酸/天冬氨酸穿梭相偶聯(lián)，其中LPD<,2>和NAGPR催化NAD(P)H:quinone氧化還原，MDH和NAGPR介導(dǎo)NADH通過蘋果酸/天冬氨酸穿梭進(jìn)入線粒體基質(zhì)，直接被LP

9、D<,2>利用，這種偶聯(lián)機(jī)制可能依賴于分子伴侶Cpn20。該復(fù)合體的生理功能在于催化一個(gè)雙電子傳遞過程，避免泛醌類自由基在線粒體中積累，對植物抵御環(huán)境脅迫，避免氧化性損傷具有重要意義。 以上研究結(jié)果表明，高山離子芥可以在細(xì)胞水平上對冷凍脅迫作出適應(yīng)性調(diào)節(jié)。在早期冷誘導(dǎo)下，細(xì)胞泛醌活躍的氧化還原性調(diào)節(jié)既可以保證電子傳遞鏈的流暢又可以穩(wěn)定細(xì)胞活性氧水平，避免細(xì)胞遭受氧化性損傷。高山離子芥線粒體能量耗散系統(tǒng)不同于其他植物，其特殊性表現(xiàn)