從線粒體介導(dǎo)的失巢凋亡途徑探討健脾益腎沖劑防治胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的分子機制.pdf

1、胃癌是嚴重威脅人民生命健康的惡性腫瘤之一，在我國胃癌的發(fā)生率在各類惡性腫瘤中居第2位，病死率居各類惡性腫瘤中第1位，在老年人群中病死率有增加的趨勢。因此，尋找有效治療胃癌的藥物和方法是目前抗腫瘤研究的一個重要課題。中醫(yī)藥療法是胃癌綜合治療中的重要手段之一，中藥對于降低術(shù)后復(fù)發(fā)率、減輕放化療不良反應(yīng)、延長患者生存期、改善患者的生存質(zhì)量有著重要的意義。健脾益腎沖劑是導(dǎo)師在長期防治胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的臨床經(jīng)驗和多年的實驗研究的基礎(chǔ)上研制而成的，

2、在實際應(yīng)用中顯示了良好的療效。本課題正是在導(dǎo)師前期工作的基礎(chǔ)上，以國家自然科學基金課題(NO.30600839)為依托開展的，研究工作從動物實驗、細胞實驗延伸至臨床，采用流式細胞技術(shù)(FCM)、TUNEL、AV/PI、Realtime RT—PCR、免疫組化(IHC)等技術(shù)，從整體——細胞——分子水平，深入探討了健脾益腎沖劑防治胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的作用機制。取得的主要研究結(jié)論和成果如下：
　　 1.健脾益腎沖劑是導(dǎo)師在長期防治胃癌

3、術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的臨床經(jīng)驗和多年的實驗研究的基礎(chǔ)上研制而成的，經(jīng)過多年的臨床應(yīng)用顯示出良好的療效。通過動物實驗進一步證實其可以抑制實驗動物復(fù)發(fā)瘤的生長，推遲肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生，還可以減少腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。其中最高復(fù)發(fā)瘤抑制率為術(shù)后10天時(63.87％)，最高肺轉(zhuǎn)移抑制率為術(shù)后5天時(40％)。
　　 2.采用TUNEL法和AV/PI雙染色兩種方法，測定615小鼠復(fù)發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶腫瘤組織細胞凋亡率，證實健脾益腎沖劑具有誘導(dǎo)615小鼠前胃癌肺

4、轉(zhuǎn)移灶和復(fù)發(fā)灶中腫瘤細胞凋亡的作用(轉(zhuǎn)移灶和復(fù)發(fā)灶細胞凋亡指數(shù)(AI％)分別為4.88±2.56％和9.53±0.26％，明顯高于模型組，P<0.05)，從而減少腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，達到一定的治療效果。誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡可能是其防治復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要作用機制之一。
　　 3.應(yīng)用免疫組化方法探討線粒體介導(dǎo)的細胞凋亡通路相關(guān)蛋白Caspase3、Caspase9、Cytc、Smac、Omi/HtrA2和XIAP的表達在其腫瘤細胞凋亡中的變

5、化規(guī)律，證實健脾益腎沖劑可以促進術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移小鼠模型肺轉(zhuǎn)移灶中促凋亡相關(guān)蛋白caspase9、caspase3、CytC、Smac和Omi/HtrA2的表達(與模型組相比P<0.05)，而對于凋亡抑制蛋白XIAP則影響不大(與模型組相比P>0.05)。說明健脾益腎沖劑可能通過上調(diào)線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑中caspase9、caspase3和CytC、Smac、Omi/HtrA2的表達，起到促腫瘤細胞凋亡作用，這可能是健脾益腎沖劑抑制腫瘤復(fù)發(fā)

6、和轉(zhuǎn)移的重要作用機制之一。這一結(jié)論也為中藥復(fù)方防治腫瘤的研究提供了更多科學依據(jù)。
　　 4.采用RT—PCR技術(shù)，測定615小鼠復(fù)發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶腫瘤組織中caspase9、3和Cytc、Smac、Omi/HtrA2、XIAP等凋亡相關(guān)蛋白的mRNA表達，進一步證明了健脾益腎沖劑具有促進術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移小鼠模型肺轉(zhuǎn)移灶中促凋亡相關(guān)蛋白caspase9、caspase3、CytC、Smac和Omi/HtrA2表達的作用(與模型組相比P<0

7、.05)，與免疫組化方法得到的結(jié)果相一致。同時健脾益腎沖劑對凋亡途徑中多個蛋白的作用及其機制的研究，也為驗證中藥復(fù)方的多靶點效應(yīng)增添了實驗依據(jù)。
　　 5.采用poly—HEMA包被的六孔板建立了人胃低分化粘液腺癌MGC803細胞系和人胃低分化腺癌BGC823細胞系的失巢模型，通過改良的轉(zhuǎn)瓶瓊脂培養(yǎng)法建立了人胃低分化粘液腺癌MGC803細胞系和人胃低分化腺癌BGC823細胞系的腫瘤多細胞球體(MTS)模型。兩種模型分別較好地模擬

8、了腫瘤細胞的失巢狀態(tài)和體內(nèi)生長狀態(tài)。
　　 6.采用MTT法證實了大鼠含藥(健脾益腎沖劑)血清對人胃癌MGC—803細胞系及BGC—823細胞系的生長均具有抑制作用，而且與空白大鼠血清抑制率相比較具有統(tǒng)計學差異，排除了大鼠血清成分對藥效的干擾。并通過對不同濃度的血清抑制率的觀測，確定了后續(xù)實驗中將要采取的含藥血清濃度和化療藥物濃度。含藥血清干預(yù)濃度為15％血清濃度，DDP的干預(yù)濃度為1μg/ml。(實驗中采用的大鼠血清藥理學方法

9、參照《中藥含藥血清體外實驗操作參考規(guī)程(草案)》)。
　　 7.通過AV/PI雙染色法檢測了大鼠含藥(健脾益腎沖劑)血清對人胃癌細胞系MGC803和BGC823失巢及多細胞球體模型的促凋亡作用，證實大鼠含藥(健脾益腎沖劑)血清對人胃癌MGC—803細胞系及BGC—823細胞系失巢模型及多細胞球體(MTS)模型生長均具有誘導(dǎo)凋亡作用(與空白大鼠血清組相比P<0.05)，凋亡率與作用時間成正比，且中藥的促凋亡作用對胃癌的這兩種細胞株

10、之間不具有差異(兩者相比者P>0.05)。
　　 8.使用FCM檢測大鼠含藥(健脾益腎沖劑)血清對人胃癌細胞系MGC803和BGC823多細胞球體(MTS)模型腫瘤細胞線粒體膜電位的作用，證實健脾益腎沖劑含藥血清可明顯降低兩種模型腫瘤細胞線粒體膜電位水平，其降低程度和作用時間呈正比。說明健脾益腎沖劑可以通過降低線粒體膜電位，誘導(dǎo)和促進腫瘤細胞凋亡，從而抑制腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移。這可能是其防治惡性腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要作用機制之一。<

11、br>　　 9.使用比色法檢測大鼠含藥(健脾益腎沖劑)血清對人胃癌細胞系MGC803和BGC823多細胞球體(MTS)模型caspase3、caspase9活性的影響，觀察到在兩種模型中均能活化和誘導(dǎo)caspase3、caspase9蛋白表達(其相對活性大鼠含藥血清組均高于空白血清組，P<0.05)。進一步證明健脾益腎沖劑可以通過促進caspase9和caspase3的活化和表達，使其參與凋亡的啟動和執(zhí)行，從而啟動caspase蛋白酶

12、級聯(lián)切割過程，進而啟動線粒體介導(dǎo)的凋亡過程，抑制腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移。本研究為中藥防治腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移提供了科學依據(jù)。
　　 10.健脾益腎沖劑可以顯著提高胃癌術(shù)后患者血清抑制人胃癌細胞系MGC803和BGC823增殖的能力。服用健脾益腎沖劑后患者血清抑制腫瘤細胞增殖能力明顯高于服用前(對腫瘤細胞抑制率由10％左右提高至40％—50％)，與正常對照組相比較也有意義(P<0.05)。這可能是其抑制腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的作用機制之一。研究患

13、者病理狀態(tài)下中藥復(fù)方含藥血清的作用，是血清藥理學方法學上的有益嘗試，其結(jié)果是否更加真實反映患者血清移行成分的作用，仍有待于進一步深入研究。
　　 本研究的創(chuàng)新之處：
　　 1.理論創(chuàng)新：本研究提出“保護失巢凋亡是防治胃癌轉(zhuǎn)移的重要機制”這一工作假說，以荷瘤小鼠術(shù)后轉(zhuǎn)移動物模型和人胃癌細胞系MGC803和BGC823失巢模型及多細胞球體培養(yǎng)模型為載體，通過線粒體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，探討健脾益腎沖劑保護胃癌轉(zhuǎn)移過程中失巢凋亡

14、的分子機制，驗證了該假說的客觀性。從一個側(cè)面揭示了中醫(yī)扶正祛邪抗腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移理論的內(nèi)涵，具有重要的理論和實踐意義。
　　 2.方法創(chuàng)新：本研究引入人胃癌細胞系MGC803和BGC823多細胞球體(MTS)培養(yǎng)模型，進行失巢凋亡及中藥復(fù)方研究，經(jīng)檢索查新，國內(nèi)外尚未見相關(guān)報道。
　　 3.指標創(chuàng)新：將線粒體凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中相關(guān)調(diào)控因子Smac、Omi/HtrA2和XIAP與胃癌的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移緊密聯(lián)系，進行深入研究探討，目前