農(nóng)桿菌介導(dǎo)白芥防御素基因轉(zhuǎn)入甘藍(lán)型油菜的研究.pdf

1、油菜(Brassica napus L．)屬于十字花科蕓苔屬，是世界四大油料作物之一，在全球產(chǎn)量中處于第三位，僅次于大豆和棕櫚油。近年來(lái)，真菌等病害造成了油菜產(chǎn)量和品質(zhì)的大幅下降，而消除病害所需要的農(nóng)藥投入巨大，同時(shí)造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。如能通過(guò)對(duì)油菜進(jìn)行轉(zhuǎn)基因改良，使其自身具有良好的抗病害能力，將具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和環(huán)保意義。 植物防御素(Plant defensins)是一種存在于多種植物中的小分子(45-54氨基酸)堿性多

2、肽。其保守的含有8個(gè)Cys，而形成4個(gè)二硫鍵。因其與動(dòng)物防御素同源而得名。植物防御素具有廣譜高效的抗微生物活性，能有效的殺滅G+、G、某些真菌、螺旋體、被膜病毒等微生物，而對(duì)植物細(xì)胞沒(méi)有傷害，是植物先天性非特異性免疫的重要組成部分。2005年羅勤等從十字花科植物白芥種子中成功地克隆了編碼植物防御素的基因，在原核表達(dá)載體GTK中對(duì)白芥防御素基因進(jìn)行了融合表達(dá)，并通過(guò)花序浸染法轉(zhuǎn)入擬南芥中進(jìn)行表達(dá)，以研究防御素基因功能。 本研究以甘

3、藍(lán)型優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)雜交油菜新品種“蜀雜九號(hào)"恢復(fù)系材料84100-18(Brassica napus L)為實(shí)驗(yàn)材料，以下胚軸為外植體，通過(guò)根癌農(nóng)桿菌EHA-105的介導(dǎo)，將其攜帶的白芥防御素基因(Sad)轉(zhuǎn)入油菜中，經(jīng)共培養(yǎng)、抗生素篩選、生根獲得了高抗性轉(zhuǎn)化植株。對(duì)所獲得的轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行了PCR檢測(cè)結(jié)果表明，外源的Sad基因已經(jīng)整合入油菜基因組中。論文還對(duì)影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化效率的主要因素進(jìn)行了分析討論。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1.通過(guò)對(duì)比觀察外

4、植體的誘導(dǎo)及分化情況，建立并優(yōu)化了油菜植株的再生體系。試驗(yàn)表明：下胚軸的分化頻率高于子葉且離生長(zhǎng)點(diǎn)0.5-1cm的下胚軸切段最高；菌液稀釋至OD<,600>0.5，浸泡時(shí)間1min，共培養(yǎng)2d；農(nóng)桿菌再懸浮液與共培養(yǎng)基中加入20mg/L 乙酰丁香酮可提高轉(zhuǎn)化頻率：AgNO<,3>可提高下胚軸芽的分化率；MS+2mg/L6-BA+1mg/L 2，4-D時(shí)芽的分化率最高；卡那霉素起始選擇濃度為10mg/L。 2.用含有Sad基因的植

5、物表達(dá)載體pBI121-Sad的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化油菜，對(duì)各項(xiàng)轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了農(nóng)桿菌EHA105轉(zhuǎn)化油菜外植體的最佳條件。確定用植株再生的最佳培養(yǎng)基分別為：Ⅰ無(wú)菌苗培養(yǎng)基：MS基本培養(yǎng)基Ⅱ預(yù)共培養(yǎng)基：MS+2mg/L 6-BA+Img/L 2，4-D+2.5mg/LAgN03+19.62mg/L.AsⅢ篩選培養(yǎng)基：MS+2mg/L 6-BA+2.5mg/LAgNO<,3>+500mg/L Carb+1.0mg/L KanⅣ生根快繁培