高山離子芥MAP激酶基因CbMAPK3的克隆及功能分析.pdf

1、為了適應(yīng)各種生物脅迫和非生物脅迫，植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成了完整的調(diào)節(jié)機(jī)制，感受外界刺激，調(diào)整基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)代謝途徑。通過(guò)完整的信號(hào)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，激活或者抑制適當(dāng)?shù)幕蛞皂憫?yīng)外界刺激。由促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)、促分裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK)、促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAPKKK)組成的磷酸化級(jí)聯(lián)途徑在酵母和動(dòng)物細(xì)胞中，起著重要的信號(hào)傳遞作用。植物中，鑒定出了多種MAP激酶基因，大量的研究表明植物MAPK激酶可以被激

2、素，非生物脅迫，病原體侵染所激活，也可以在細(xì)胞分裂的特定時(shí)期被激活。 高山離子芥是稀有的高山冰緣植物，具有較高的適應(yīng)寒冷環(huán)境的能力。由于高山離子芥是一種脅迫耐受植物，我們克隆得到了高山離子芥中與抗逆境脅迫有關(guān)的MAP激酶基因CbMAPK3，并通過(guò)RT-PCR和Westernblotting分析等方法研究了MAPK在高山離子芥抵御非生物脅迫過(guò)程中所發(fā)揮的作用。研究結(jié)果如下： (1)獲得了高山離子芥MAP激酶基因CbMAPK

3、3，全長(zhǎng)1419bp，其中包括1110bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)，91bp的5`非翻譯區(qū)(5`UTR)，218bp的3`非翻譯區(qū)(3`UTR)，包括15bp的polyA。該基因編碼一個(gè)369個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量42.5kDa，等電點(diǎn)(PI)5.79。由于該基因與擬南芥AtMPK3同源性最高，達(dá)到了90％以上，因此命名為CbMAPK3(genbankaccessionnumber：AY805424)。CbMAPK3包含有MAP激酶所具

4、有的11個(gè)保守序列區(qū)，以及MAP激酶的磷酸化位點(diǎn)TEY基序。因此該基因很可能編碼一個(gè)MAP激酶蛋白。 (2)序列分析結(jié)果顯示，該蛋白與植物抗逆境脅迫有關(guān)的MAP激酶亞組A有很高的同源性，CbMAPK3與ArabidopsisAtMPK3同源性最高，達(dá)到了95％，其次是NicotianatabacumNtWIPK(82％)，CapsicumannuumCaMPK1(81％)，PsMAPK3(80％)，MedicagosativaM

5、sMMK4(80％)，PetrosecinumcrispumPARSLEYMAPK(80％)。應(yīng)用SOPMA在線分析將CbMAPK3預(yù)測(cè)蛋白序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，CbMAPK3預(yù)測(cè)蛋白序列包含46％α-螺旋(alphahelix)，13％伸展鏈(extendedstrand)，6％β-轉(zhuǎn)角(betaturn)，35％無(wú)規(guī)卷曲(randomcoil)。α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲為該蛋白的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)。 (3)研究了CbMAPK3

6、在高山離子芥不同的組織中的表達(dá)情況，結(jié)果表明，CbMAPK3的表達(dá)沒(méi)有組織特異性。 (4)通過(guò)半定量RT-PCR.分析，研究了高山離子芥CbMAPK3基因在低溫，高鹽脅迫以及ABA處理下轉(zhuǎn)錄水平的變化。結(jié)果表明，植物材料在4℃處理下，CbMAPK3基因的轉(zhuǎn)錄水平迅速增長(zhǎng)，并在處理0.5小時(shí)之后達(dá)到最高值，然后表達(dá)量逐漸降低，處理24h后，降低到了基礎(chǔ)水平。當(dāng)植物材料在-4℃下處理時(shí)，CbMAPK3激酶基因的轉(zhuǎn)錄水平同樣迅速增長(zhǎng)，

7、并且在處理24小時(shí)時(shí)仍然保持在較高的水平。CbMAPK3基因的轉(zhuǎn)錄也受到ABA以及高鹽脅迫的誘導(dǎo)，在ABA的處理下，CbMAPK3基因的轉(zhuǎn)錄在30min內(nèi)明顯升高，并在處理12小時(shí)之后逐漸降低。因此，CbMAPK3可能屬于ABA依賴型。在高鹽脅迫的誘導(dǎo)下，CbMAPK3基因的轉(zhuǎn)錄在2小時(shí)之后達(dá)到一個(gè)很高的水平，并且在48小時(shí)的處理時(shí)間內(nèi)一直維持在一個(gè)較高的水平。綜上所述，CbMAPK3的轉(zhuǎn)錄受到低溫、高鹽以及ABA的誘導(dǎo)。脅迫條件下MA

8、P激酶基因轉(zhuǎn)錄水平的增加可以相應(yīng)的增加可供激活的蛋白激酶的量。因此，可以得出結(jié)論，雖然MAP激酶主要在翻譯后被磷酸化激活以后起作用，但轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控在MAP激酶級(jí)聯(lián)途徑中同樣發(fā)揮著重要作用。 (5)研究了CbMAPK3蛋白水平在低溫以及其它環(huán)境脅迫下的變化。結(jié)果顯示，高山粒子芥懸浮細(xì)胞在4℃處理下，CbMAPK3激酶蛋白質(zhì)水平在處理前3個(gè)小時(shí)有所增加，并在3小時(shí)時(shí)達(dá)到最高值，然后逐漸降低，處理24h后，降低到了基礎(chǔ)水平。當(dāng)懸浮細(xì)

9、胞在0℃下處理時(shí)，CbMAPK3激酶蛋白質(zhì)水平只有很微弱的增加。當(dāng)懸浮細(xì)胞在150mMNaCL下處理時(shí)，蛋白質(zhì)水平在3-12小時(shí)內(nèi)明顯高于基礎(chǔ)水平，在處理24小時(shí)時(shí)又降低到了基礎(chǔ)水平。脅迫條件下MAP激酶蛋白水平的增加同樣可以相應(yīng)的增加可供激活的蛋白激酶的量。因此，MAP激酶蛋白水平的調(diào)控在MAP激酶級(jí)聯(lián)途徑中同樣發(fā)揮著重要作用。 (6)為了進(jìn)一步研究CbMAPK3本身是否具有抗?jié)B透脅迫的功能。將CbMAPK3連接表達(dá)載體pET

10、-30a中，轉(zhuǎn)化E.coli(srl∷Tn10)，在IPTG的誘導(dǎo)下，檢測(cè)轉(zhuǎn)化菌株在在含有l(wèi)M山梨醇的M9培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化有CbMAPK3的E.coli(srl∷Tn10)和沒(méi)有轉(zhuǎn)化CbMAPK3的E.coli(srl∷Tn10)的生長(zhǎng)情況基本一致，沒(méi)有明顯的差異。因此，CbMAPK3本身沒(méi)有抗?jié)B透脅迫的功能，可能作為信號(hào)傳遞物質(zhì)在環(huán)境脅迫過(guò)程中發(fā)揮作用。 (7)CbMAPK3在大腸桿菌BL21中的表達(dá)。SDS-

11、PAGE電泳結(jié)果表明帶有重組表達(dá)質(zhì)粒的陽(yáng)性菌株，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生了約46kD的蛋白帶，與由核苷酸序列推導(dǎo)的目的蛋白分子量大小相符。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至NC膜上進(jìn)行免疫學(xué)反應(yīng)，結(jié)果顯示，CbMAPK3能被抗擬南芥MAP激酶AtMPK3的抗體α-C-MPK3特異地識(shí)別。從而驗(yàn)證了在高山離子芥全蛋白中可以被α-C-MPK3抗體特異地識(shí)別的蛋白為CbMAPK3。同時(shí)，為進(jìn)一步鑒定CbMAPK3激酶體外酶活性奠定了基礎(chǔ)。 從