髓源抑制細(xì)胞與慢性丙型肝炎患者抗病毒治療預(yù)后關(guān)系研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　丙型病毒性肝炎是一種嚴(yán)重威脅人類健康的傳染性疾病，在世界范圍內(nèi)廣泛流行，目前全球大約有1.85億人感染丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）。HCV感染后有74-86％的人發(fā)展為以肝纖維化為主要特征的慢性丙型肝炎（chronic hepatitis C virus, CHC），并有潛在發(fā)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌傾向。中國(guó)人群HCV感染率為3.2%，HCV感染在中國(guó)已經(jīng)成為乙型病毒性肝炎、結(jié)核、

2、痢疾之后第四大傳染性疾病，尤其是35歲以上人群的HCV感染率持續(xù)增長(zhǎng)，嚴(yán)重威脅著個(gè)人健康，給家庭和社會(huì)造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
　　目前抗病毒治療是慢性丙型肝炎唯一有效的治療手段。自2011年直接作用抗病毒（direct acting antivirals，DAAs）藥物問(wèn)世以來(lái)，丙型肝炎的治療取得了突破性進(jìn)展。研究顯示，在西方發(fā)達(dá)國(guó)家，HCV NS5B核苷酸類似物sofosbuvir聯(lián)合利巴韋林或其他抗病毒藥物能夠治愈90%的HC

3、V感染者。然而，由于價(jià)格昂貴，sofosbuvir等核苷酸類似物抗 HCV藥物在我國(guó)至今仍未上市，基于干擾素聯(lián)合利巴韋林的抗病毒治療方案目前仍是中國(guó)和一些發(fā)展中國(guó)家公認(rèn)的治療慢性丙型肝炎的首選藥物。然而，按照傳統(tǒng)的聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療，仍會(huì)有將近50%的 CHC患者不能獲得持久病毒學(xué)應(yīng)答（ sustained virological response， SVR）。因此，篩選影響抗病毒治療療效的可能因素，完善抗病毒治療方案

4、就顯得尤為重要。
　　髓源抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）是由骨髓祖細(xì)胞和非成熟的髓樣細(xì)胞組成的異質(zhì)細(xì)胞群體，包括不成熟粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cells, DCs）等。其共同的特征是：骨髓起源、未成熟狀態(tài)和顯著的T細(xì)胞抑制功能。MDSCs在人體內(nèi)主要出現(xiàn)在外周血中。最近研究顯示髓源抑制細(xì)胞可以在腫瘤、自身免疫性疾病、病毒感染性疾病中大量積聚，并與疾

5、病的不良預(yù)后有密切關(guān)系。當(dāng)發(fā)生微生物、寄生蟲(chóng)或病毒感染、化療、自身免疫性疾病、應(yīng)激以后，均會(huì)促進(jìn)MDSCs增多。一項(xiàng)研究顯示HCV慢性感染可以誘導(dǎo)MDSCs的增長(zhǎng)，該群細(xì)胞能夠有效抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖和IFN-γ的產(chǎn)生,導(dǎo)致HCV感染的慢性化。最近的報(bào)道顯示抗HCV病毒治療后，HCV慢性感染者血液中的HCV病毒載量與MDSCs具有相同的下降趨勢(shì)，證明HCV病毒能夠促進(jìn)MDSCs的產(chǎn)生。大量研究已證實(shí)MDSCs數(shù)量的增長(zhǎng)與腫

6、瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)，但MDSCs與丙型肝炎患者抗病毒治療臨床預(yù)后的關(guān)系尚不十分清楚。本次研究重點(diǎn)了解髓源抑制細(xì)胞對(duì) CHC患者干擾素聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療臨床預(yù)后的影響及其潛在的機(jī)制。
　　研究材料與方法：
　　1研究材料
　　2011年6月至2013年6月間，鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科和消化內(nèi)科收治的初治慢性丙型肝炎感染者共計(jì)206例（血清檢測(cè)HCV RNA和HCV抗體均陽(yáng)性，既往未接受過(guò)干擾素聯(lián)合利巴韋林治療），

7、均接受標(biāo)準(zhǔn)療程聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療（PEG-IFN/RBV），停藥隨訪24周。所有患者排除以下情況：妊娠或哺乳期婦女，酒精性肝病、藥物性肝病、以及失代償期肝硬化者，合并其他肝炎病毒及艾滋病感染者，6個(gè)月內(nèi)接受過(guò)免疫抑制劑治療者，自身免疫性疾病患者，嚴(yán)重精神性疾病特別是抑郁癥患者，惡性腫瘤、甲狀腺疾病及吸毒或酗酒者，嚴(yán)重心腦血管疾病患者。共有180例病例最終完成整個(gè)治療和隨訪計(jì)劃、資料齊全，被納入統(tǒng)計(jì)分析。其中127例獲得

8、持久病毒學(xué)應(yīng)答（SVR），53例未獲得持久病毒學(xué)應(yīng)答（Non-SVR）。20例健康人組成健康對(duì)照組。
　　2研究方法
　　本次研究采用巢式病例對(duì)照研究方法，從病例就診住院跟蹤隨訪到治療停藥滿24周，觀察SVR獲得情況。未獲得SVR的病例為病例組，獲得SVR的病例為對(duì)照組。隨訪觀察和收集了所有病例的人口學(xué)特征、臨床病理參數(shù)以及接受PEG-IFN/RBV治療療效的相關(guān)數(shù)據(jù)；采集初治慢性丙型肝炎患者PEG-IFN/RBV抗病毒治療

9、前后外周靜脈血10ml，密度梯度離心法獲得單個(gè)核細(xì)胞，流式細(xì)胞儀（FACS）檢測(cè) HLA-DR-/lowCD33+CD14+CD11b+ cell(M-MDSC)和 HLA-DR-/lowCD33+CD14-CD11b+cell(G-MDSC)細(xì)胞含量及STAT3表達(dá)水平、CD4+T和CD8+ T細(xì)胞增殖、功能、細(xì)胞周期和表型；采用流式細(xì)胞儀分選純化 M-MDSC和G-MDSC，qRT-PCR檢測(cè)兩群細(xì)胞免疫抑制性基因表達(dá)；MDSC與磁

10、珠分選的CD4+T和CD8+T細(xì)胞共孵育，研究其對(duì)T細(xì)胞免疫抑制功能及表型變化的影響。
　　使用EPIDATA3.0建立數(shù)據(jù)庫(kù)錄入數(shù)據(jù)。應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件（version16.0;SPSS Inc, Chicago, IL, USA）和GraphPad Prism software(version5.0; San Diego, CA, USA)處理分析數(shù)據(jù)。定量資料符合正態(tài)分布時(shí)采用x±s表示，采用 One-Way ANOVA

11、test比較兩組間變量差異，多組間變量比較采用Student-Newman-Keuls（SNK）檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布時(shí)采用中位數(shù)和區(qū)間表示，使用非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗(yàn)分析兩組間變量差異，Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)分析多組間變量差異，兩兩組間比較采用Nemenyi method檢驗(yàn)。定性資料使用絕對(duì)數(shù)或百分比表示，根據(jù)需要采用 Chi-square檢驗(yàn)或 Fisher’s exact probability檢驗(yàn)變

12、量的組間差異。采用Pearson相關(guān)或Spearman相關(guān)分析變量間線性相關(guān)關(guān)系，采用單因素二分類Logistic回歸篩選影響HCV感染者干擾素聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療預(yù)后的影響因素，將有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量放入多因素二分類Logistic回歸分析，確定影響CHC患者抗病毒治療預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。采用Receiver operating characteristic curve(ROC)分析確定MDSCs預(yù)測(cè)SVR的最佳診斷界值（cut-of

13、f值）。采用雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　研究結(jié)果：
　　第一部分影響慢性丙型肝炎患者抗病毒治療預(yù)后因素研究
　　1206例初治CHC患者納入研究隊(duì)列，其中180例完成標(biāo)準(zhǔn)抗病毒治療和隨訪， SVR應(yīng)答率為70.6%；
　　2根據(jù)MDSCs表型，將其分為G-MDSCs（HLA-DR-/lowCD33+CD14-CD11b+）和M-MDSCs（HLA-DR-/lowCD33+CD14+CD11b+），Non

14、-SVR組G-MDSCs顯著高于SVR組和健康對(duì)照（P<0.05），三組M-MDSCs差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；
　　3 G-MDSCs與HCV RNA載量（r=0.41,P<0.01）、ALT（r=0.51,P<0.01）、AST（r=0.46,P<0.01）、LSM（r=0.58,P<0.01）呈正相關(guān)關(guān)系，與CD4+T細(xì)胞（r=-0.24,P<0.01）和CD8+T細(xì)胞（r=-0.26,P<0.01）呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；M

15、-MDSCs與HCV RNA載量、ALT、AST、CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞均無(wú)相關(guān)關(guān)系（P>0.05）。
　　4 ROC分析顯示G-MDSCs對(duì)SVR的預(yù)測(cè)價(jià)值最大，其最佳診斷界值為5.38%；
　　5單因素和多因素Logistic回歸分析顯示HCV基因型（CI.95%:3.75-12.33；P<0.01）、外周血G-MDSCs水平（CI.95%:1.62-5.47；P=0.01）和RVR（CI.95%:1.34-8.

16、48；P=0.03）是CHC患者抗病毒治療獲得SVR的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。
　　第二部分慢性丙型肝炎患者M(jìn)DSCs對(duì)T細(xì)胞功能及表型的影響
　　1 HCV核心蛋白可誘導(dǎo)PBMCs細(xì)胞表型向G-MDSCs（HLA-DR-/lowCD33+CD11b+CD14-）轉(zhuǎn)化而不是 M-MDSCs（HLA-DR-/lowCD33+CD11b+CD14+），PEG-IFN/RBV通過(guò)降低 HCV RNA減少G-MDSCs含量；
　　2 G

17、-MDSCs能通過(guò)細(xì)胞-細(xì)胞接觸方式顯著抑制 CD4+T細(xì)胞和 CD8+T細(xì)胞增殖、IFN-γ分泌，Non-SVR患者G-MDSC抑制T細(xì)胞增殖的能力明顯強(qiáng)于SVR患者（P<0.05），而兩組人群 M-MDSC對(duì) T細(xì)胞增殖抑制能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；
　　3 G-MDSC可以促進(jìn)T細(xì)胞凋亡（P<0.05），而M-MDSC則不會(huì)（P>0.05），Non-SVR患者G-MDSC促進(jìn)T細(xì)胞凋亡的能力顯著高于SVR患者（P

18、<0.05）；
　　4 G-MDSC能夠顯著降低S期和G2期CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞而增加G0-G1期T細(xì)胞比例（P<0.05）；
　　5 G-MDSC與中心記憶性CD4+T細(xì)胞（r=-0.46，P<0.01）和中心記憶性CD8+T細(xì)胞（r=-0.28，P=0.02）呈負(fù)相關(guān)關(guān)；M-MDSC與各記憶性T細(xì)胞亞群均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性（P>0.05）；
　　6 CHC患者G-MDSCs與Treg細(xì)胞呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.

19、42，P<0.05），并可誘導(dǎo)Treg細(xì)胞生成（P<0.05）；M-MDSCs與Treg細(xì)胞無(wú)線性相關(guān)關(guān)系（r=0.23，P=0.08），不能誘導(dǎo)Treg細(xì)胞增長(zhǎng)（P>0.05）；
　　7 CHC患者M(jìn)DSCs誘導(dǎo)T細(xì)胞表型的改變，上調(diào)T細(xì)胞表達(dá)PD-1（P<0.05）、CTLA-4和Tim-3（P<0.05），下調(diào)OX40表達(dá)（P<0.05）。
　　第三部分慢性丙型肝炎患者M(jìn)DSCs抑制T細(xì)胞機(jī)制研究
　　1 Non

20、-SVR患者血清中Arg-1、COX-2、iNOS、TGF-β、IL-6、IL-10表達(dá)高于健康人和SVR患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；
　　2 Non-SVR患者G-MDSC的Arg-1、COX-2、iNOS、TGF-β、IL-6和IL-10基因表達(dá)高于健康人和SVR患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；
　　3 Non-SVR患者G-MDSCs中STAT3及p-STAT3表達(dá)高于健康人和SVR患者，差異有統(tǒng)計(jì)

21、學(xué)意義（P<0.05），而M-MDSC中STAT3及p-STAT3表達(dá)在三組人群中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；
　　4 CHC患者使用S31-201阻斷MDSC的STAT3，STAT3、p-STAT3以及Arg-1水平均有顯著下降（P<0.05）；
　　5相對(duì)于未阻斷STAT3的G-MDSC，阻斷STAT3后，G-MDSC對(duì)CD4+ T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞增殖和IFN-γ分泌抑制功能顯著下降（P<0.05）；
　

22、　6 IL-10刺激能顯著增加G-MDSC的Arg-1、COX-2、iNOS、TGF-β和IL-6表達(dá)（P<0.05）；S31-201阻斷STAT3可以抑制IL-10活化STAT3引起的Arg-1、COX-2、iNOS、TGF-β和IL-6表達(dá)增加（P>0.05）；
　　7 IL-10能夠促進(jìn)G-MDSC的STAT3和p-STAT3活化（P<0.05），不能促進(jìn)M-MDSC的STAT3和p-STAT3活化（P>0.05）；S31-

23、201能夠降低MDSC的STAT3和p-STAT3活化（P<0.05）；
　　8 IL-10能夠促進(jìn)G-MDSC的Arg-1、COX-2、iNOS、TGF-β和IL-6 mRNA基因表達(dá)（P<0.05），S31-201能夠阻斷IL-10的這一作用。
　　結(jié)論：
　　1 G-MDSCs與HCV RNA載量、ALT、AST、LSM呈正相關(guān)關(guān)系，與CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，是CHC患者抗病毒治療獲得SVR的

24、獨(dú)立預(yù)測(cè)因素；
　　2 HCV核心蛋白可促進(jìn)G-MDSCs而不是M-MDSCs增加，PEG-IFN/RBV通過(guò)抑制HCV復(fù)制顯著降低G-MDSCs；
　　3 G-MDSCs能顯著抑制CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的增殖、IFN-γ分泌，促進(jìn)T細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)中心記憶性CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞分化、Treg細(xì)胞擴(kuò)增，上調(diào)T細(xì)胞表面PD-1、CTLA-4和Tim-3表達(dá)；
　　4 IL-10能夠通過(guò)激活MDSC的STA