HCV核心蛋白對人Huh7肝癌細(xì)胞mRNA,lncRNA和circRNA表達(dá)的影響及其致癌機制初探.pdf

1、丙型肝炎病毒(HCV)與慢性肝炎，肝硬化和原發(fā)性肝癌(HCC)的形成密切相關(guān)。核心蛋白作為構(gòu)成HCV衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)蛋白，是HCV最重要的成分之一，其參與了包括HCV的免疫逃逸，因HCV感染導(dǎo)致的肝纖維化和HCC等肝臟疾病和抵抗藥物治療等過程。HCC作為一種高致死率的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率持續(xù)升高，而細(xì)胞周期異常，凋亡抵抗和癌基因及相關(guān)通路的激活是其發(fā)生的主要分子機制。非編碼RNA(ncRNA)是不編碼蛋白質(zhì)的RNA的總稱，其中的長非編碼

2、RNA(lncRNA)是近年來生物醫(yī)學(xué)研究的熱點內(nèi)容，其參與了生物生長發(fā)育和包括HCC在內(nèi)的諸多疾病發(fā)病過程。新近發(fā)現(xiàn)的環(huán)狀RNA(circRNA)由于其獨特的結(jié)構(gòu)和具有的如吸附miRNA以及參與癌癥發(fā)生發(fā)展的相關(guān)信號通路等生物學(xué)功能，得到了越來越多的關(guān)注。已報道發(fā)現(xiàn)，有l(wèi)ncRNA參與到了乙型肝炎病毒(HBV)導(dǎo)致的肝癌中，例如HBV的HBx蛋白能下調(diào)lncRNA-Dreh從而促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。但HCV或者其核心蛋白通過調(diào)控lnc

3、RNA分子導(dǎo)致HCC的研究卻極為鮮見，考慮到HCV與HBV的相似性，可以推測HCV或者HCV核心蛋白導(dǎo)致HCC的過程中可能有l(wèi)ncRNA分子的參與。此外，circRNA在疾病診斷和治療中的具有巨大的研究與應(yīng)用前景，基于以上研究背景，本研究開展了如下工作:
　　目的:
　　以HCV1b基因型核心蛋白作為研究對象，探討HCV核心蛋白對人Huh7肝癌細(xì)胞mRNA、lncRNA和circRNA表達(dá)的影響的研究，并初步分析HCV核心蛋

4、白導(dǎo)致的HCC致癌的相關(guān)分子機制。
　　方法:
　　構(gòu)建重組表達(dá)載體PEGFP-Core（HCV核心蛋白為基因型為1b），將該重組表達(dá)載體和空載體PEGFP-C1分別轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，經(jīng)G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株并用RT-PCR檢測核心蛋白的表達(dá)。在抽提RNA后通過lncRNA芯片和環(huán)狀RNA(circRNA)芯片分析得到HCV核心蛋白表達(dá)對Huh7細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響情況。隨后找出表達(dá)差異＞2.0的lncRNA分子和cir

5、cRNA分子，通過生物信息學(xué)分析，找出這些變化的分子與相關(guān)生理病理改變的關(guān)聯(lián)性;并同時結(jié)合閱讀文獻(xiàn)和利用相關(guān)分子靶位點預(yù)測平臺，挑選相關(guān)基因并給出預(yù)測的可能致癌通路，對其中的相關(guān)基因的差異表達(dá)情況進(jìn)qPCR驗證，最后通過構(gòu)建相關(guān)相關(guān)基因的重組表達(dá)載體并瞬時轉(zhuǎn)染Huh7-core細(xì)胞克隆，從而進(jìn)一步對相關(guān)的信號通路進(jìn)行探究。
　　結(jié)果:
　　LncRNA芯片包含兩個部分，其中l(wèi)ncRNA檢測部分含有30586個基因位點，mRN

6、A檢測部分含有26109個基因位點。結(jié)果顯示，與對照組相比，有4851個lncRNA表達(dá)上調(diào)和3569個lncRNA表達(dá)下調(diào)超過2倍;4785個mRNA表達(dá)上調(diào)和3192個mRNA表達(dá)下調(diào)超過對照組基因表達(dá)2倍。CircRNA芯片（含有5396個位點），分別發(fā)現(xiàn)了823個基因表達(dá)上調(diào)和419個基因表達(dá)下調(diào)超過對照組基因表達(dá)2倍。通過聚類分析和GO分析發(fā)現(xiàn)，這些分子參與了包擴細(xì)胞內(nèi)大分子代謝，核酸代謝等代謝過程以及DNA損傷反應(yīng)，鈣離子通

7、道調(diào)控等生化反應(yīng)。通過KEGG Pathway分析，這些分子與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，凋亡，鈣離子信號途徑，Wnt信號途徑，HBV，HCV感染等信號通路存在關(guān)聯(lián)。此外經(jīng)過qPCR驗證了預(yù)測的信號通路中高表達(dá)或低表達(dá)的10個相關(guān)分子。最后通過構(gòu)建信號通路中的相關(guān)分子（miR122，miR192，miR204）的基因表達(dá)載體，探討了其表達(dá)對通路中其它分子可能的調(diào)控作用。
　　結(jié)論:
　　miR204-HPCAL1，HOTTIP-GLS，和C