葛根芩連湯含藥血清及其主要代謝物對人肝癌huh7細(xì)胞株P(guān)38MAPK信號通路的作用及差異蛋白表達(dá)的研究.pdf

1、肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）屬于消化系統(tǒng)惡性腫瘤，肝癌患者的死亡率在全球排第三位，每年可發(fā)生高達(dá)700000例的病例。發(fā)病原因大多是由病毒性肝炎、酒精或肝毒物質(zhì)引起。對于肝癌的治療，臨床上一般以手術(shù)切除和化療作為主要手段，但是目前使用的化療藥物不良反應(yīng)大、選擇性差、易引起耐藥性，因此，選取中藥對肝癌進(jìn)行治療的優(yōu)勢日益突出，目前，已有大量關(guān)于中藥治療肝癌的研究，并且許多中藥活性成分已經(jīng)被證實(shí)具有治療肝癌

2、的藥理活性。
　　葛根芩連湯來源于漢·張仲景《傷寒論》，處方由葛根、甘草、黃芩和黃連四味藥組成，是中醫(yī)藥配伍精華理論的名方之一。中藥復(fù)方成分多，作用靶點(diǎn)多，經(jīng)吸收入血生物轉(zhuǎn)化后，產(chǎn)生療效的可能是存在于復(fù)方中的藥物原型，也可能是復(fù)方代謝產(chǎn)物或新物質(zhì)?；谥兴帍?fù)方的特點(diǎn)，對中藥復(fù)方藥效的研究不應(yīng)該只局限于研究復(fù)方整體的作用，或只研究復(fù)方中單一成分及含量較高的成分，應(yīng)當(dāng)充分考慮中藥復(fù)方的藥代動力學(xué)特點(diǎn)，選取中藥復(fù)方含藥血清與主要代謝入血

3、成分作為對象進(jìn)行研究，并結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)及血清藥理等方法，從復(fù)方含藥血清與主要代謝物入手，可以更充分有效地闡明中藥復(fù)方的作用機(jī)理。目前對于葛根芩連湯的大多數(shù)研究都只限于整方及主要單體的質(zhì)量控制及藥效作用研究，而主要單體成分不一定是最好的藥效活性成分，基于對葛根芩連湯整方及代謝成分藥效作用的相關(guān)研究較少，本研究將以此對葛根芩連湯進(jìn)行更深入、更詳盡地開發(fā)研究，此外，本研究方法也為復(fù)方的研究及新化合物作為先導(dǎo)藥物提供了新的思路。
　　本研

4、究利用MTT比色法、實(shí)時熒光定量PCR法和western blot法研究葛根芩連湯含藥血清及其主要代謝物對huh7肝癌細(xì)胞株P(guān)38MAPK信號通路的影響和相互關(guān)系。首先通過MTT法確定含藥血清組及各代謝物組給藥濃度，再用熒光定量PCR法檢測huh7細(xì)胞P38MAPK信號通路中各基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平；Western blot法檢測huh7細(xì)胞P38MAPK信號通路中各蛋白的表達(dá)情況。蛋白質(zhì)凝膠電泳結(jié)果表示，葛根芩連湯含藥血清組對P38、J

5、NK的表達(dá)有上調(diào)作用，對ERK的表達(dá)有下調(diào)作用；葛根素對ERK的表達(dá)有下調(diào)作用，對JNK的表達(dá)有上調(diào)作用；大豆苷對P38、JNK的表達(dá)有上調(diào)作用；大豆苷苷元對P38的表達(dá)有上調(diào)作用(P<0.05)。通過研究結(jié)果可知，葛根芩連湯與葛根素、大豆苷、大豆苷苷元對P38MAPK信號通路的影響各不相同，但三者藥效的協(xié)同作用是與葛根芩連湯一致的，因此，選取葛根芩連湯及其主要代謝物進(jìn)行平行研究，可以更好地揭示葛根芩連湯發(fā)揮藥效作用的機(jī)制，更有利于對葛

6、根芩連湯及其藥效物質(zhì)之間的關(guān)系進(jìn)行深入探索和開發(fā)。
　　本研究將血清藥理學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)中2-DE技術(shù)相互結(jié)合，通過分析大鼠對照血清和大鼠給藥血清作用后的兩組huh7細(xì)胞雙向電泳圖譜，尋找兩組中的差異蛋白，從而能夠準(zhǔn)確、有效地展示與葛根芩連湯作用相關(guān)的蛋白。研究結(jié)果表明，大鼠對照血清組細(xì)胞與大鼠給藥血清組細(xì)胞，兩組差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)為60個，利用質(zhì)譜成功鑒定出5個差異蛋白，分別為：纖連蛋白（Fibronectin）、Deoxyur

7、idine5’-triphosphate nucleotidohydrolase、銅-鋅超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase[Cu-Zn]）、腺苷酸環(huán)化酶1（Adenylate cyclase type1）、GDP解離抑制因子(Rho GDP dissociation inhibitor，GDI)。其中，纖連蛋白、Deoxyuridine5’-triphosphate nucleotidohydrolase、銅-鋅超