高效降解棉酚菌種的選育及棉籽餅粕生物發(fā)酵的研究.pdf

1、棉籽餅粕富含蛋白質(zhì)，是很好的植物蛋白飼料資源。但因其含有對(duì)動(dòng)物有毒的游離棉酚，其利用價(jià)值和使用量受到極大限制。為此，人們研究了許多脫毒方法，如有機(jī)溶劑浸提、硫酸亞鐵處理、氫氧化鈣處理以及微生物發(fā)酵等方法。這些方法在棉籽餅粕脫毒方面起到了重要作用，但有機(jī)溶劑浸提法存在有機(jī)溶劑殘留問題，對(duì)動(dòng)物有潛在的危害；硫酸亞鐵處理影響飼料品質(zhì)和降低采食量：氫氧化鈣處理脫毒效率相對(duì)較低。微生物發(fā)酵法是一種有發(fā)展前景的方法，該法不但能脫除棉籽餅粕中的棉酚，

2、而且還可以提高棉籽餅粕的蛋白質(zhì)含量，發(fā)酵底物中存留許多酶類(微生物分泌，如纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶和脂解酶)、維生素、氨基酸以及一些促生長(zhǎng)因子，因而受到了廣泛重視。 本課題通過選育高效降解棉酚的菌株，優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)，探討影響發(fā)酵脫毒效果的因素，考察復(fù)合發(fā)酵脫毒效果及其影響因素等途徑來研究棉籽餅粕生物發(fā)酵效果。 通過醋酸棉酚無糖查氏培養(yǎng)基和醋酸棉酚麥芽汁培養(yǎng)基平板篩選和培育技術(shù)，并利用棉籽餅生物發(fā)酵的方法，選育出一株對(duì)棉

3、酚具有較高脫毒率的菌種熱帶假絲酵母ZD-3(Candida tropicalis ZD-3)。熱帶假絲酵母ZD-3細(xì)胞呈卵圓形，大小為3～4×4～5μm，出芽繁殖。用麥芽汁液體培養(yǎng)該菌，菌體沉淀于管底。平板培養(yǎng)菌落有皺紋，可形成假菌絲。熱帶假絲酵母ZD-3不能在半?yún)捬鯒l件下發(fā)酵棉子糖以及在好氧條件下同化利用棉子糖，因此在利用該菌進(jìn)行棉籽餅發(fā)酵脫毒時(shí)，應(yīng)注意可發(fā)酵糖類物質(zhì)(如淀粉)的補(bǔ)充。在液體培養(yǎng)基中，熱帶假絲酵母ZD-3用于研究的適宜

4、取種時(shí)間為12～18 h(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)。利用熱帶假絲酵母ZD-3對(duì)棉籽餅進(jìn)行固體發(fā)酵脫毒，通過對(duì)底物游離棉酚含量的測(cè)定，優(yōu)化其發(fā)酵工藝參數(shù)。優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表明，底物組成適宜比例為棉籽餅70％、玉米粉20％、小麥麩10％。棉籽餅發(fā)酵脫毒的最佳條件參數(shù)為：發(fā)酵時(shí)間48h，發(fā)酵溫度30℃，菌液接種量5％(v/w)，底物水分含量50％，自然pH值。利用熱帶假絲酵母ZD-3對(duì)不同因子處理的棉籽餅底物進(jìn)行生物固體發(fā)酵，然后測(cè)定發(fā)酵底物中游離棉酚(FG

5、)、蛋白質(zhì)含量等指標(biāo)，探討糖源、加熱處理、尿素、硫酸亞鐵、碳酸鈉以及礦物質(zhì)等因素對(duì)棉籽餅生物發(fā)酵脫毒效果的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，棉籽餅底物中加入不同的可發(fā)酵糖源，可顯著提高脫毒效率，其中淀粉效果最好，脫毒率高達(dá)91.91％；加熱處理可顯著降低FG含量，有利于棉籽餅底物的發(fā)酵脫毒；但底物中添加尿素，可降低棉籽餅發(fā)酵脫毒率，不利于熱帶假絲酵母ZD-3發(fā)酵脫毒；底物中添加硫酸亞鐵、碳酸鈉和復(fù)合礦物質(zhì)，可顯著提高假絲酵母ZD-3對(duì)棉籽餅的發(fā)酵脫毒

6、率，脫毒率分別高達(dá)94.70％、93.96％以及96.67％。 棉籽餅底物中分別加入0、0.5％、1％、2％的乙醇胺或氯化膽堿，混合均勻，然后進(jìn)行熱處理試驗(yàn)和微生物發(fā)酵試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，棉籽餅底物中加入不同比例的乙醇胺或氯化膽堿，不利于棉籽餅熱處理脫毒和發(fā)酵脫毒。 通過測(cè)定發(fā)酵底物FG含量、底物蛋白酶活性(中性、堿性和酸性)和底物菌量的方法研究氯化膽堿、乙醇胺、卵磷脂以及全脂大豆對(duì)發(fā)酵效果的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，①在底物

7、熱處理?xiàng)l件下發(fā)酵，氯化膽堿、乙醇胺、卵磷脂和全脂大豆均無促進(jìn)發(fā)酵脫毒作用，除氯化膽堿外，均顯著降低發(fā)酵脫毒效率；氯化膽堿、乙醇胺和卵磷脂可極顯著提高中性蛋白酶活性；氯化膽堿和卵磷脂可極顯著提高堿性蛋白酶活性；各處理因素均可極顯著提高底物酸性蛋白酶活性；各處理因素可極顯著提高底物菌體含量，其中氯化膽堿效果最好。②在底物非熱處理?xiàng)l件下發(fā)酵，乙醇胺、卵磷脂和全脂大豆均無促進(jìn)發(fā)酵脫毒作用，且顯著降低發(fā)酵脫毒效率，但氯化膽堿有促進(jìn)發(fā)酵脫毒的趨勢(shì)；

8、卵磷脂和全脂大豆可極顯著提高中性蛋白酶活性；各處理因素可極顯著提高底物堿性蛋白酶活性，極顯著降低底物酸性蛋白酶活性；氯化膽堿可極顯著提高底物菌量，而其它因素處理的底物菌量顯著降低。⑧研究發(fā)現(xiàn)氯化膽堿對(duì)棉籽餅底物發(fā)酵脫毒和底物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有重要的意義，其底物蛋白酶活性高、菌量多。在底物非熱處理?xiàng)l件下發(fā)酵，低濃度氯化膽堿具有促進(jìn)發(fā)酵脫毒的作用。 利用熱帶假絲酵母ZD-3和黑曲霉ZD-8對(duì)棉籽餅進(jìn)行單菌及復(fù)合菌種發(fā)酵，然后測(cè)定發(fā)酵底物中游

9、離棉酚(FG)、粗纖維(CF)、粗脂肪(EE)、氨基酸含量，體外法測(cè)定飼料蛋白質(zhì)氨基酸消失率，用環(huán)境掃描電鏡拍攝底物發(fā)酵后的顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)變化等研究復(fù)合發(fā)酵效果。試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合發(fā)酵可極顯著地降低棉籽餅底物游離棉酚含量，脫毒率為91.64％；棉籽餅底物粗蛋白、總氨基酸、必需氨基酸含量分別提高27.83％、18.15％、19.18％；提高粗蛋白、總氨基酸及必需氨基酸體外消化率分別為20.90％、26.16％、24.47％，賴氨酸和蛋氨酸分

10、別增加20.24％、66.29％。底物CF和EE含量顯著降低。環(huán)境掃描電鏡圖片表明，復(fù)合發(fā)酵處理棉籽餅底物后，黑曲霉形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，其菌絲變細(xì)，未觀察到孢子頭，只見光禿禿的頂囊。酵母菌形態(tài)未發(fā)現(xiàn)有明顯變化。試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合發(fā)酵效果明顯優(yōu)于單菌發(fā)酵棉籽餅底物的效果，不但達(dá)到棉酚脫毒的目的，而且發(fā)酵飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值顯著提高。復(fù)合發(fā)酵時(shí)，熱帶假絲酵母ZD-3對(duì)黑曲霉ZD-8的形態(tài)變化有顯著影響。 利用熱帶假絲酵母ZD-3和黑曲霉ZD-

11、8對(duì)不同因子處理的棉籽餅底物進(jìn)行復(fù)合固體發(fā)酵，然后測(cè)定發(fā)酵底物中游離棉酚(FG)、蛋白質(zhì)含量等指標(biāo)探討發(fā)酵時(shí)間、底物棉籽餅比例、碳酸鈉、加熱處理、硫酸亞鐵以及礦物質(zhì)等處理因素對(duì)棉籽餅復(fù)合發(fā)酵脫毒效果的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合發(fā)酵適宜時(shí)間為48h；底物適宜的組成比例為棉籽餅70％、玉米粉20％、小麥麩10％；在底物中添加0.5％～1.0％的碳酸鈉可提高復(fù)合發(fā)酵脫毒率。加熱處理可極顯著降低FG含量，有利于棉籽餅底物的發(fā)酵脫毒；底物中添加硫酸