體內(nèi)外研究羥基膽固醇硫酸基轉(zhuǎn)移酶(SULT2B1b)在脂類代謝中的功能及機制.pdf

1、胞漿硫酸基轉(zhuǎn)移酶(SULT)2B1b催化25-羥化膽固醇(25HC)硫酸化，反應(yīng)主要產(chǎn)物為3-硫酸-25-羥化膽固醇(25HC3S)。研究發(fā)現(xiàn)該硫酸化產(chǎn)物可通過抑制LXR/SREBPs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路降低THP-1來源的巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)水平。因此，合成25HC3S的關(guān)鍵限速酶SULT281b可能在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝中起重要作用。本實驗中，我們在原代人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)研究SULT2B1b對脂質(zhì)代謝的作用及機制，并在小鼠非酒精性脂肪性肝病模型中檢測SU

2、LT2B1b的表達(dá)及其重要的生理意義。
　　本研究共包括三部分內(nèi)容，詳細(xì)如下：
　　第一部分：預(yù)實驗及其它文獻(xiàn)報道，羥基類固醇硫酸基轉(zhuǎn)移酶(SULT2B1b)同樣表達(dá)于原代人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞及小鼠肝臟組織內(nèi)，但表達(dá)量較低。為了更好的研究SULT2B1b及其所產(chǎn)生的內(nèi)源性硫化固醇對脂質(zhì)代謝的作用及機制，在這些細(xì)胞或組織內(nèi)過表達(dá)SULT2B1b是一種比較合理的方法，所以我們構(gòu)建含SUET2B1b基因的腺病毒載體。
　　第二部

3、分：利用我們所構(gòu)建的含SULT2B1b基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染原代人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞，研究SULT281b對脂質(zhì)代謝的影響。選用該細(xì)胞系作為我們的研究對象，是因為血管內(nèi)皮細(xì)胞在動脈粥樣硬化等脂質(zhì)代謝紊亂相關(guān)疾病中發(fā)揮重要作用。結(jié)果顯示，腺病毒(Ad-SULT281b)感染后，SULT281b基因在原代人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)成功過表達(dá)；加入[H3]標(biāo)記的25-羥化膽固醇(25HC)追蹤其代謝變化，2小時后約40％25HC被硫酸化，24小時后大于50

4、％25HC被硫酸化，HPLC鑒定硫酸化產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)主要為3-硫酸-25-羥化膽固醇(25HC3S)；進(jìn)一步檢測細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)水平的變化，發(fā)現(xiàn)在25HC存在的情況下，過表達(dá)SULT2B1b顯著降低細(xì)胞內(nèi)甘油三酯、總膽固醇、游離膽固醇及游離脂肪酸，并降低脂質(zhì)合成相關(guān)基因，包括LXRα、SREBP-1、ACC1、FAS和HMGR等蛋白及mRNA水平；然而在沒有25-羥化膽固醇存在，或在T0901317(化學(xué)合成的LXR激動劑)存在的情況下，過表達(dá)SU

5、LT2B1b降脂作用不明顯。表明SULT2B1b的降脂作用豐要是通過其形成的內(nèi)源性25HC3S而產(chǎn)生的，并非其自身直接作用。另外，我們還在相對高表達(dá)SULT2B1b的HepG2細(xì)胞內(nèi)，采用干擾RNA技術(shù)敲除SULT2B1b基因的表達(dá)，反面驗證氧化固醇硫酸化的降脂作用。
　　第三部分：高脂或高膽固醇飼養(yǎng)C57BL/6及LDLR-/-敲基因小鼠建立非酒精性脂肪性肝病模型，通過尾靜脈注射含SULT2B1b基因的腺病毒，研究其在小鼠體內(nèi)對

6、脂質(zhì)代謝的作用。小鼠被隨機分為三組，即C57BL/6小鼠高膽固醇飼養(yǎng)組，C57BL/6小鼠高膽固醇飼養(yǎng)并腹腔注射25HC組，LDLR-/-敲基因小鼠高脂飼養(yǎng)組。每組又分為感染SULT2B1b和對照病毒β-Gal組。每小組5-6只小鼠。結(jié)果顯示，過表達(dá)SULT2B1b的小鼠血清及肝臟組織內(nèi)脂質(zhì)水平(包括甘油三酯、膽固醇及游離脂肪酸)與相應(yīng)組別內(nèi)的對照病毒組明顯下降，其中C57BL/6小鼠高膽固醇飼養(yǎng)并腹腔注射25HC組及LDLR-/-敲基

7、因小鼠高脂飼養(yǎng)組更為明顯。HPLC分析肝臟內(nèi)氧化固醇及硫酸化的氧化固醇發(fā)現(xiàn)，C57BL/6小鼠高膽固醇飼養(yǎng)并腹腔注射25HC組過表達(dá)SULT2B1b后，氧化固醇明顯下降而硫酸化的氧化固醇則明顯升高，而沒有腹腔注射25HC的小鼠變化不明顯。脂質(zhì)相關(guān)基因檢測發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SULT2B1b后，LXRα、SREBP-1、ACC1和FAS蛋白及mRNA水平均明顯下降。另外，我們也分離了小鼠主動脈，正常C57BL/6小鼠飼養(yǎng)高膽固醇10周后均未檢測到動