煙草糖基轉(zhuǎn)移酶基因sm-Ngt1啟動(dòng)子功能及其在擬南芥中的過(guò)表達(dá)研究.pdf

1、糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosytransferase，GT)是催化活化的供體糖基轉(zhuǎn)移到特異受體生成糖苷鍵的酶，廣泛存在于生物體。GTs家族是一個(gè)超家族，根據(jù)GTs的底物特異性和序列同源性以及糖苷鍵立體化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分類，GTs 可劃分為91個(gè)家族。許多植物生理生化反應(yīng)與糖基化相關(guān)，GT 在糖基化過(guò)程中扮演重要角色。如GTs 能使一些信號(hào)分子或激素糖基化，參與信號(hào)調(diào)節(jié)及植物激素平衡；部分GTs 參與的反應(yīng)與植物抗性反應(yīng)有關(guān)。 本實(shí)驗(yàn)室從

2、煙草中克隆到一個(gè)受甲基茉莉酸(MeJA)和水楊酸(SA)雙重誘導(dǎo)的新糖苷轉(zhuǎn)移酶基因sm-Ngt1，將該基因啟動(dòng)子5’端部分缺失的5個(gè)啟動(dòng)子片段取代pCAMBIA1301 質(zhì)粒的35S 啟動(dòng)子，構(gòu)建5個(gè)以GUS為報(bào)告基因的表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化煙草，研究啟動(dòng)子活性，發(fā)現(xiàn)pGTPB(-800～+1)的轉(zhuǎn)化煙草植株受MeJA和SA 誘導(dǎo)后GUS 活性增強(qiáng)，pGTC(-600～+1)具有組成型強(qiáng)啟動(dòng)子的特性。以植物表達(dá)載體pCAMBIA1305.1 構(gòu)

3、建了35S 啟動(dòng)的sm-Ngt1 超表達(dá)載體pZ，轉(zhuǎn)化煙草。在陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株中，在苗期有不同程度的表型變異，主要表現(xiàn)為矮化及葉脈增粗。本實(shí)驗(yàn)在此工作基礎(chǔ)上，以5’端缺失的啟動(dòng)子構(gòu)建的pGTPB和pGTPC表達(dá)載體采用浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥，研究了這兩個(gè)5’端部分缺失的啟動(dòng)子片段在擬南芥的啟動(dòng)活性；以sm-Ngt1 超表達(dá)載體pZ轉(zhuǎn)化擬南芥，研究了對(duì)擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育的影響。取得如下結(jié)果。 1. pGTPB轉(zhuǎn)化擬南芥，經(jīng)潮霉素篩選，特異引物P

4、CR 鑒定，得到了大量轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。在獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化苗中，取30 株進(jìn)行水、水楊酸和茉莉酸處理，熒光法檢測(cè)GUS 酶活，其中16 株轉(zhuǎn)基因苗未誘導(dǎo)時(shí)活性較低，受水楊酸和茉莉酸誘導(dǎo)后GUS 活性大大增強(qiáng)，雙誘導(dǎo)植株數(shù)達(dá)50％；2 株無(wú)明顯變化；3 株受SA 誘導(dǎo)，而受MeJA 抑制；3 株受SA 抑制，但受MeJA 誘導(dǎo)；6 株受SA和MeJA 雙重抑制。熒光定量PCR 檢測(cè)8 株幼苗RNA 水平的表達(dá)，結(jié)果表明，部分MeJA和SA 誘

5、導(dǎo)后GUS 酶活性增加的植株，gus RNA 表達(dá)量也呈現(xiàn)相應(yīng)的增加趨勢(shì)。MeJA和SA 處理后，GUS 酶活性減弱的幼苗，gus RNA 表達(dá)量也減少。GUS組織染色結(jié)果表明，根、莖、葉及花等各部位均能表達(dá)，在維管組織染色最深。 2. pGTPC轉(zhuǎn)化擬南芥，經(jīng)潮霉素篩選，GUS 染色鑒定，獲得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。熒光法檢測(cè)了24 株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的GUS 酶活，大部分植株是強(qiáng)表達(dá)。 3. Sm-Ngt1 超表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南