骨橋蛋白在介導(dǎo)黃韌帶骨化過程中的作用機(jī)制研究.pdf

1、研究目的：
　　黃韌帶骨化病會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的脊髓神經(jīng)損傷，因其缺乏有效的藥物及其它保守治療手段，手術(shù)是唯一的有效治療方法，但手術(shù)后脊髓神經(jīng)恢復(fù)程度有限。前期研究發(fā)現(xiàn)黃韌帶骨化組織中骨橋蛋白及其受體的表達(dá)，能誘導(dǎo)體外黃韌帶骨化細(xì)胞的骨化指標(biāo)表達(dá)增加，并能誘導(dǎo)黃韌帶骨化動(dòng)物模型，說明骨橋蛋白在黃韌帶骨化中起著重要作用。但骨橋蛋白在黃韌帶骨化過程中的具體作用機(jī)制尚不清楚，本研究旨在從分子通路方面進(jìn)一步闡明骨橋蛋白在黃韌帶骨化發(fā)生過程中的作用

2、機(jī)制。
　　研究方法：
　　通過組織學(xué)以及分子生物學(xué)的相關(guān)研究手段明確骨橋蛋白在誘導(dǎo)黃韌帶骨化發(fā)病過程中的作用機(jī)制，并通過動(dòng)物模型進(jìn)行驗(yàn)證，從而明確OPN在誘導(dǎo)人黃韌帶細(xì)胞骨向分化中的作用。
　　2.1 人OLF骨化組織和未骨化的黃韌帶中的OPN和OPN受體的表達(dá)。
　　分組:將黃韌帶骨化標(biāo)本分成兩個(gè)組，分別為黃韌帶骨化組以及非黃韌帶骨化組，兩組各8例。
　　免疫組織化學(xué):將手術(shù)中取的黃韌帶骨化標(biāo)本經(jīng)過多聚

3、甲醛固定，并組織脫鈣，石蠟包埋后切片后進(jìn)行OPN、CD44以及Integrin的免疫組織化學(xué)染色，封片觀察染色結(jié)果。
　　2.2 黃韌帶細(xì)胞分離、培養(yǎng)及OPN的骨化誘導(dǎo)。
　　分離與培養(yǎng):利用組織塊貼壁法分離人的黃韌帶細(xì)胞，分離后的組織塊繼續(xù)貼壁使用，分離出來的細(xì)胞倒置顯微鏡觀察其生長(zhǎng)形態(tài)，長(zhǎng)到匯合后傳代，多的細(xì)胞液氮凍存?zhèn)溆谩?br>　　誘導(dǎo):將體外培養(yǎng)的第三代黃韌帶細(xì)胞種到六孔板中，培養(yǎng)24h后用濃度為100ng/ml的

4、OPN進(jìn)行干預(yù)48h，WB檢測(cè)骨化指標(biāo)ALP以及OCN在干預(yù)前后的表達(dá)變化。
　　2.3 骨橋蛋白誘導(dǎo)黃韌帶骨化的分子通路的檢測(cè)與確定
　　MAPK信號(hào)通路磷酸化檢測(cè):將體外培養(yǎng)的第三代黃韌帶細(xì)胞種于六孔板中，用濃度為100ng/ml的OPN進(jìn)行干預(yù)，分別在0min、15min、30min、60min、120min時(shí)間點(diǎn)終止干預(yù)，WB檢測(cè)MAPK信號(hào)通路分子ERK1/2、P38、JNK在時(shí)間梯度上的磷酸化情況。
　　信

5、號(hào)通路阻滯:分別用ERK1/2、P38特異的抑制劑U0126、SB203580抑制ERK1/2和P38信號(hào)分子的磷酸化24h后，WB檢測(cè)在OPN誘導(dǎo)黃韌帶細(xì)胞48h后的骨化指標(biāo)ALP以及OCN的表達(dá)變化。
　　2.4 SB203580抑制P38信號(hào)分子對(duì)OPN誘導(dǎo)OLF動(dòng)物模型的影響
　　動(dòng)物模型的處理:在4℃下分別將OPN組:OPN-matrigel、P38阻滯組:OPN-SB203580-matrigel和ERK阻滯組:

6、OPN-U0126-matrigel，經(jīng)椎板間隙注入到黃韌帶。術(shù)后12周Micro-CT檢查各組黃韌帶骨化情況。
　　研究結(jié)果：
　　3.1 OLF黃韌帶和骨化組織中的OPN和OPN受體的表達(dá)
　　在所有8例黃韌帶骨化組織中的軟骨細(xì)胞周圍可見OPN和CD44表達(dá)陽性，而Integrin表達(dá)陰性;而OPN、CD44和Integrin在未骨化的黃韌帶細(xì)胞周圍表達(dá)均陽性，而且在黃韌帶內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞周圍也均成陽性表達(dá)。

7、　　3.2 黃韌帶細(xì)胞分離、培養(yǎng)及誘導(dǎo)
　　組織塊貼壁分離出的黃韌帶細(xì)胞大小形狀不一，細(xì)胞基質(zhì)透亮，細(xì)胞形態(tài)以梭形以及紡錘形為主，同時(shí)也有部分細(xì)胞形態(tài)呈五角形和橢圓形。原代黃韌帶細(xì)胞自胸椎黃韌帶組織塊爬出的早期呈散在性分布，隨后進(jìn)展逐漸生長(zhǎng)密集，并以黃韌帶組織塊為中心，細(xì)胞向外周呈輻射狀生長(zhǎng)，在和其他黃韌帶組織塊中的原代細(xì)胞交會(huì)時(shí)，則會(huì)發(fā)展為渦旋狀生長(zhǎng)。黃韌帶骨化組細(xì)胞中呈五角形和橢圓形的細(xì)胞比非黃韌帶骨化組多，并在顯微鏡視野中可

8、見多個(gè)散在細(xì)胞結(jié)節(jié)分布。WB檢測(cè)骨化組的黃韌帶細(xì)胞較正常組細(xì)胞OPN表達(dá)水平增加。OPN干預(yù)OLF-LFC，WB檢測(cè)可見骨化指標(biāo)ALP、OCN的表達(dá)增加。
　　3.3 骨橋蛋白誘導(dǎo)黃韌帶骨化的分子通路的檢測(cè)與確立
　　在0min、15min、30min、60min、120min不同時(shí)間點(diǎn)，隨著OPN干預(yù)時(shí)間的增加通過WB檢測(cè)的ERK1/2以及P38信號(hào)分子的磷酸化水平也逐漸增加，但JNK的磷酸化水平隨時(shí)間的延長(zhǎng)變化不明顯。在

9、P38的抑制劑SB203580的作用下，OPN誘導(dǎo)的骨化組黃韌帶細(xì)胞的骨化指標(biāo)ALP以及OCN的表達(dá)水平較未阻滯組顯著下調(diào)，且跟空白組的表達(dá)水平接近。但在ERK1/2的抑制劑U0126作用下則對(duì)OPN誘導(dǎo)的骨化作用抑制不明顯。
　　3.4 SB203580阻斷P38通路對(duì)OPN誘導(dǎo)OLF動(dòng)物模型的影響
　　術(shù)后12周Micro-CT檢查見OPN組和ERK阻滯組均可見黃韌帶區(qū)可見高密度影，而P38阻滯組未見黃韌帶區(qū)高密度表現(xiàn)。

10、
　　研究結(jié)論：
　　4.1 黃韌帶骨化區(qū)域中表達(dá)OPN及其受體CD44，但未發(fā)現(xiàn)其受體integrin的表達(dá)，而在未骨化區(qū)中特別是在血管內(nèi)皮細(xì)胞周圍表達(dá)OPN、CD44以及integrin。
　　4.2 通過體外組織塊貼壁法能有效的培養(yǎng)出黃韌帶細(xì)胞，OPN能誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的骨化組黃韌帶細(xì)胞表達(dá)ALP等成骨指標(biāo)表達(dá)增加。
　　4.3 OPN能激活MAPK信號(hào)通路中的ERK1/2以及P38信號(hào)分子的磷酸化，而JNK信