骨橋蛋白不同轉(zhuǎn)錄本在乳腺癌發(fā)生中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、乳腺癌是影響女性身心健康的常見腫瘤，全球范圍內(nèi)每年有超過13.8萬人發(fā)病，并有約45.8萬患者死于乳腺癌，因此對乳腺癌的防治已成為重大公共衛(wèi)生議題。目前，由于缺乏完善的篩查標(biāo)準(zhǔn)和治療靶點(diǎn)，乳腺癌往往在晚期才被診斷，因此，乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)是提高療效的關(guān)鍵。此外，三陰乳腺癌缺乏有效的治療靶點(diǎn)，而多數(shù)ER+乳腺癌患者對輔助激素療法產(chǎn)生抗性。因此，迫切需要新的治療靶點(diǎn)以提高乳腺癌的早期診斷并改善傳統(tǒng)治療的療效。
　　骨橋蛋白(Osteop

2、otin，OPN)是一種多功能的磷酸化糖蛋白分子，在生理病理過程如骨重建、腫瘤發(fā)生和炎癥中具有重要作用。多種類型腫瘤高表達(dá)OPN，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，使用特異性siRNA敲減OPN可顯著抑制腫瘤的發(fā)生;相反，過表達(dá)OPN可以使惡性低的細(xì)胞系向惡性轉(zhuǎn)移性轉(zhuǎn)化。機(jī)制研究表明OPN主要通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖和抑制凋亡等途徑促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，非常有望成為新的腫瘤生物標(biāo)記分子。相比腫瘤細(xì)胞，免疫細(xì)胞也表達(dá)OPN，是OPN的另一重要來源。免疫細(xì)胞來源的OP

3、N具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用，參與調(diào)節(jié)Th1、Th17免疫應(yīng)答，在自身免疫疾病中作用顯著。另外，免疫細(xì)胞來源的OPN可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，在細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用。因此，腫瘤來源的OPN和宿主來源的OPN在宿主免疫和腫瘤發(fā)生中具有截然不同功能。此外，巨噬細(xì)胞來源的OPN可恢復(fù)由于敲除OPN所致的腫瘤細(xì)胞遷移的下降，提示不同來源的OPN可相互作用。然而，腫瘤細(xì)胞來源的OPN是否能夠通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的分化和功能進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸仍

4、知之甚少。
　　通過選擇性剪切，人OPN可形成3種不同轉(zhuǎn)錄本形式:OPN-a(全長)，OPN-b（缺少外顯子5）和OPN-c（缺少外顯子4）。目前有關(guān)OPN不同轉(zhuǎn)錄本的研究主要集中在腫瘤中，OPN轉(zhuǎn)錄本在多種類型腫瘤包括肝細(xì)胞癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、軟組織肉瘤中表達(dá)和功能特異。OPN-a和OPN-c誘導(dǎo)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲，而在前列腺癌中，OPN-b和OPN-c發(fā)揮促腫瘤作用。在卵巢癌和乳腺癌中，僅OPN-c促進(jìn)

5、腫瘤進(jìn)展。肺癌中，OPN-b影響增殖，而OPN-c則與腫瘤的侵襲相關(guān)。臨床數(shù)據(jù)顯示OPN-c特異性在乳腺癌中表達(dá)，而在正常組織和癌旁不表達(dá)。并且與傳統(tǒng)的乳腺癌診斷和預(yù)后判斷分子雌激素受體、孕激素受體和HEE2相比，OPN-c對于乳腺癌的診斷和預(yù)后判斷更有臨床價(jià)值。體外功能實(shí)驗(yàn)表明OPN-c較其他的轉(zhuǎn)錄本更能支持乳腺癌的錨定非依賴性生長。此外，最近的研究發(fā)現(xiàn)，OPN的轉(zhuǎn)錄本差異調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子VEGF的表達(dá)及血管生成作用。這些結(jié)果均提

6、示OPN不同的轉(zhuǎn)錄本可介導(dǎo)不同的功能，可能與其在腫瘤發(fā)生和宿主免疫中的功能差異有關(guān)。傳統(tǒng)的治療如化療和放療可引起“脫靶效應(yīng)”，而靶向腫瘤組織特異性表達(dá)的OPN轉(zhuǎn)錄本有望成為特異性更強(qiáng)的治療方法和策略。然而，OPN不同轉(zhuǎn)錄本在體內(nèi)是否介導(dǎo)不同的功能，是否能夠通過調(diào)節(jié)局部免疫細(xì)胞分化和功能進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生還知之甚少。
　　本課題在已有研究的基礎(chǔ)上，首次通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)深入探討OPN不同轉(zhuǎn)錄本在介導(dǎo)腫瘤發(fā)生中的作用及差異。通過液相懸浮芯片技

7、術(shù)分析OPN不同轉(zhuǎn)錄本調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)的表達(dá)譜，進(jìn)一步闡明OPN不同轉(zhuǎn)錄本在乳腺癌發(fā)生中的作用。此外，本研究從免疫學(xué)角度探討了腫瘤來源的不同OPN轉(zhuǎn)錄本對單核細(xì)胞分化、NK細(xì)胞殺傷功能的影響，以期進(jìn)一步補(bǔ)充OPN在腫瘤發(fā)生及腫瘤免疫逃逸中的作用及機(jī)制。
　　第一部分OPN轉(zhuǎn)錄本促進(jìn)乳腺癌體內(nèi)成瘤
　　目的:構(gòu)建OPN不同轉(zhuǎn)錄本慢病毒表達(dá)載體，荷瘤小瘤模型探討不同OPN轉(zhuǎn)錄本對乳腺癌體內(nèi)成瘤的影響。
　　方法:<

8、br>　　1.OPN轉(zhuǎn)錄本PCR調(diào)取
　　以乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-435（表達(dá)OPN不同轉(zhuǎn)錄本）cDNA為模板，利用PCR方法釣取OPN轉(zhuǎn)錄本。
　　2.pGC-FU-OPN表達(dá)載體構(gòu)建及驗(yàn)證
　　PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切定向連接至pGC-FU質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，PCR、測序鑒定陽性克隆，將構(gòu)建好的融合蛋白表達(dá)載體進(jìn)行超純?nèi)?nèi)毒素抽提。過表達(dá)載體脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)、WesternBlot檢

9、測OPN以確認(rèn)融合基因表達(dá)。
　　3.OPN轉(zhuǎn)錄本慢病毒載體包裝
　　將OPN過表達(dá)質(zhì)粒與兩種輔助包裝原件載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，制備慢病毒表達(dá)載體，標(biāo)定病毒滴度。
　　4.慢病毒轉(zhuǎn)染MCF-7
　　將構(gòu)建好的OPN轉(zhuǎn)錄本及對照組慢病毒轉(zhuǎn)染不表達(dá)內(nèi)源OPN的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，RT-PCR、WesternBlot、ELISA檢測OPN表達(dá)是否成功。
　　5.MTT檢測細(xì)胞增殖
　　體外檢測OP

10、N轉(zhuǎn)錄本對MCF-7增殖的影響。
　　6.體內(nèi)成像系統(tǒng)檢測OPN轉(zhuǎn)錄本對腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的影響
　　將轉(zhuǎn)染OPN轉(zhuǎn)錄本及對照慢病毒的MCF-7細(xì)胞注射小鼠腋下，體內(nèi)成像系統(tǒng)檢測GFP+腫瘤細(xì)胞原位生長及肝、肺轉(zhuǎn)移。8周后，處死，分離腫瘤細(xì)胞，測量腫瘤體積;肝臟、肺組織，10％甲醛固定，用于病理分析。
　　結(jié)果:
　　1.pGC-FU-OPN轉(zhuǎn)錄本表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功:
　　PCR結(jié)果確認(rèn)OPN轉(zhuǎn)錄本成功調(diào)取，菌落

11、PCR選取陽性克隆進(jìn)行測序，結(jié)果顯示pGC-FU-OPN轉(zhuǎn)錄本成功構(gòu)建，將構(gòu)建好的過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化293T細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)，WesternBlot檢測OPN，確認(rèn)OPN轉(zhuǎn)錄本過表達(dá)成功。
　　2.慢病毒包裝
　　Real-time結(jié)果顯示OPN轉(zhuǎn)錄本的慢病毒表達(dá)載體滴度達(dá)到109TU/ml數(shù)量級(jí)。
　　3.MCF-7成功過表達(dá)OPN轉(zhuǎn)錄本
　　RT-PCR、WesternBlot表明OPN不同轉(zhuǎn)錄本在

12、MCF-7細(xì)胞中過表達(dá)成功，ELISA檢測到腫瘤培養(yǎng)上清中OPN的分泌。
　　4.OPN轉(zhuǎn)錄本促進(jìn)MCF-7增殖
　　MTT結(jié)果顯示過表達(dá)OPN轉(zhuǎn)錄本均顯著促進(jìn)MCF-7增殖，轉(zhuǎn)錄本之間無顯著差異。
　　5.OPN轉(zhuǎn)錄本促進(jìn)體內(nèi)成瘤
　　所有OPN轉(zhuǎn)錄本均顯著促進(jìn)腫瘤體內(nèi)生長，但轉(zhuǎn)錄本之間并沒有顯著差異。此外，模型中并未檢測到腫瘤的肝臟、肺臟轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)論:OPN轉(zhuǎn)錄本慢病毒表達(dá)載體成功構(gòu)建，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均

13、表明OPN促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長，但OPN轉(zhuǎn)錄本之間并無顯著差異。
　　第二部分腫瘤來源OPN轉(zhuǎn)錄本誘導(dǎo)單核細(xì)胞選擇性活化
　　目的:探討腫瘤來源OPN轉(zhuǎn)錄本對單核細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制，補(bǔ)充OPN促進(jìn)腫瘤免疫逃逸的分子機(jī)制。
　　方法:
　　1.腫瘤上清制備:
　　無血清1640培養(yǎng)轉(zhuǎn)染OPN轉(zhuǎn)錄本及pGC慢病毒的MCF-7(1×105/ml)24h，10000g離心5min，收集上清。機(jī)制實(shí)驗(yàn)中用阻斷抗體

14、或重組細(xì)胞因子處理腫瘤上清。
　　2.單核細(xì)胞分選:
　　密度低度離心分離健康獻(xiàn)血員外周血單個(gè)核細(xì)胞，CD14磁珠陽性分選單核細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞純度。
　　3.腫瘤上清與單核細(xì)胞共培養(yǎng):
　　調(diào)整單核細(xì)胞濃度為2×105/ml，與腫瘤上清共培養(yǎng)40h，收集細(xì)胞，一部分用于表型分析;另一部分單核細(xì)胞加PBS洗細(xì)胞，然后100ng/mlLPS刺激6h，收取上清，用于檢測細(xì)胞因子。
　　4.流式細(xì)胞術(shù):

15、r>　　用于分析MCF-7表面CD44、αⅤβ3的水平;檢測共培養(yǎng)單核細(xì)胞表面HLA-DRCD206、CD163的水平。
　　5.懸浮芯片:
　　檢測過表達(dá)OPN轉(zhuǎn)錄本或者rhOPN刺激的腫瘤上清中細(xì)胞因子的水平。
　　6.ELISA:
　　檢測rhOPN刺激的腫瘤上清中MCP-1、TGF-β1的水平;檢測共培養(yǎng)單核細(xì)胞細(xì)胞因子的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.OPN轉(zhuǎn)錄本差異調(diào)節(jié)CD163
　　與

16、轉(zhuǎn)染OPN-a和OPN-b相比，過表達(dá)OPN-c顯著上調(diào)單核細(xì)胞CD163。但過表達(dá)OPN轉(zhuǎn)錄本的腫瘤上清對HLA-DR和CD206沒有顯著作用。
　　2.OPN轉(zhuǎn)錄本調(diào)節(jié)單核細(xì)胞TNF-α、IL-10的表達(dá)
　　過表達(dá)OPN轉(zhuǎn)錄本的上清均顯著抑制單核細(xì)胞TNF-α，促進(jìn)IL-10的水平。
　　3.OPN通過CD44通路調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞TGF-β1和MCP-1表達(dá)
　　過表達(dá)OPN轉(zhuǎn)錄本顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞TGF-β1和

17、MCP-1的表達(dá)，但不影響IL-6、IL-8和MCP-1的水平;rhOPN確認(rèn)其對TGF-β1和MCP-1的調(diào)節(jié)作用;MCF-7表達(dá)CD44，不表達(dá)αⅤβ3，阻斷CD44通路抑制OPN對TGF-β1和MCP-1的誘導(dǎo)作用。
　　4.OPN通過TGF-β1和MCP-1調(diào)節(jié)單核細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)
　　通過使用阻斷抗體和重組細(xì)胞因子，我們證明腫瘤來源OPN分別通過MCP-1和TGF-β1調(diào)節(jié)單核細(xì)胞TNF-α和IL-10
　　

18、結(jié)論:OPN通過CD44調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞MCP-1和TGF-β1的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)單核細(xì)胞選擇性活化，可能是腫瘤免疫逃逸的另一重要機(jī)制。
　　第三部分OPN通過NKG2D-MICA促進(jìn)腫瘤逃避NK殺傷
　　目的:探討OPN對NKG2D-MICA通路及NK細(xì)胞殺傷的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步揭示OPN在腫瘤免疫逃逸中的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.MCF-7與NK92共培養(yǎng)
　　rhOPN刺激MCF-7細(xì)胞，然后與NK92

19、細(xì)胞按照1∶1的比例共培養(yǎng)不同時(shí)間，流式細(xì)胞術(shù)檢測殺傷。
　　2.殺傷檢測
　　共培養(yǎng)細(xì)胞，標(biāo)記CD56和AnnexinⅤ抗體，流式細(xì)胞術(shù)分析CF56-腫瘤細(xì)胞AnnexinⅤ陽性率，評價(jià)殺傷。
　　3.RT-PCR
　　RT-PCR方法檢測MICA、MMP-14和ADAM-17的水平。
　　4.細(xì)胞表面MICA水平檢測
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞表面MICA的水平。
　　5.sMICA檢測

20、r>　　MCF-7細(xì)胞用rhOPN，ELISA檢測上清中sMICA水平。
　　結(jié)果:
　　1.OPN促進(jìn)腫瘤抵抗NK殺傷
　　NK92細(xì)胞表達(dá)CD56，MCF-7細(xì)胞不表達(dá)CD56，通過使用CD56區(qū)分共培養(yǎng)體系中的兩種細(xì)胞。經(jīng)OPN刺激的MCF-7與NK92共培養(yǎng)后CD56-腫瘤細(xì)胞AnnexinⅤ陽性率顯著低于未經(jīng)OPN刺激組。
　　2.OPN促進(jìn)MICA剪切
　　rhOPN并不影響MICAmRNA的表

21、達(dá)，顯著下調(diào)MCF-7表面MICA的水平，并可顯著增加腫瘤上清中sMICA的水平。
　　3.OPN通過ADAM-17促進(jìn)MICA剪切
　　OPN可顯著誘導(dǎo)ADAM17的表達(dá)，不影響MMP-14的水平;特異性阻斷ADAM17可抑制MICA的剪切，并且部分恢復(fù)NK92對MCF-7的殺傷。
　　結(jié)論:我們的研究表明OPN可促進(jìn)MICA的剪切，破壞NGG2D-MICA之間的相互作用，進(jìn)而促使腫瘤抵抗NK的殺傷作用，豐富了OPN