硫氧還蛋白在乳腺癌中的功能研究.pdf

1、硫氧還蛋白 (Thioredoxin，Trx)是一類分布廣泛的小分子多功能蛋白，它們在進化上相當(dāng)保守，都具有一個相同的有氧化還原活性的Cys-Gly-Pro-Cys的氨基酸序列。哺乳動物的Trx家族包括Trx-1和Trx-2。它們在其保守的活化區(qū)域內(nèi)含有具備氧化還原活性的二硫巰基和二硫醇，因此硫氧還蛋白在細胞內(nèi)行使著各種不同的功能。硫氧還蛋白系統(tǒng)是由硫氧還蛋白、硫氧還蛋白還原酶、NADPH 三部分組成的。硫氧還蛋白系統(tǒng)可催化還原氫過氧化

2、物、有機過氧化物以及一些被氧化的蛋白，是一個在自然界中普遍存在的系統(tǒng)。癌組織中Trx-1的過量表達會促進細胞的增殖和抑制細胞的凋亡，其機制是為DNA的合成提供平衡的氧化還原環(huán)境和活化轉(zhuǎn)錄因子等。關(guān)于它抑制細胞凋亡的機制仍在不斷的研究中。由于Trx-1 對腫瘤細胞的促進生長和抑制凋亡作用，它正成為治療癌癥和阻止癌癥發(fā)生的分子靶點。
　　 某些癌癥病人的血清中Trx-1的濃度是較高的，但乳腺癌病人的血清和正常人的血清中的Trx-1

3、含量并不清楚。Trx-1 對細胞周期的作用也未見報道。Trx-1 對細胞凋亡中的作用有一不致的報道。為此我們進行了以下的研究：
　　 1)利用RT-PCR 技術(shù)從MCF-7 細胞中擴增獲得了Trx-1基因，構(gòu)建了該基因的原核表達載體pET32a-Trx，在E.coli 中獲得了高效表達的融合蛋白，并利用親和層析的方法成功地對其進行了純化，純化的蛋白大小與預(yù)期一致。
　　 2)利用純化的Trx-1蛋白對新西蘭大白兔進行免疫

4、，制備出相應(yīng)的多克隆抗體，經(jīng)間接ELISA 法檢測其效價為1:10000，并對Trx-1 具有特異性，可以用于ELISA或western blot 實驗。
　　 3)利用間接ELISA 法對正常人和乳腺癌病人的血清中的Trx-1的濃度進行測定，發(fā)現(xiàn)乳腺癌病人的外周血中Trx-1的含量低于正常人。
　　 4)構(gòu)建了真核表達載體pcDNA-Trx，并將其轉(zhuǎn)染到乳腺癌細胞系MCF-7 中。
　　 5)研究了Trx-1

5、對細胞周期的影響。用維生素C 刺激乳腺癌細胞MCF-7，或者用pcDNA-Trx 轉(zhuǎn)染MCF-7 使細胞中的Trx-1 表達升高，另外在細胞培養(yǎng)基中加入不同濃度的Trx-1，再用流式細胞儀檢測細胞中進入S 期細胞的比例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)維生素C的刺激使細胞體內(nèi)Trx-1 表達上升，更多的細胞進入到S 期。轉(zhuǎn)染pcDNA-Trx的細胞Trx-1的表達上升，進入S 期的細胞比例明顯增加。將Trx-1蛋白加入到培養(yǎng)基中后，進入S 期的細胞比例明顯地隨

6、Trx-1的濃度的提高而升高。這些結(jié)果都說明無論在細胞體外還是體內(nèi)，Trx-1 水平的上升均會促使細胞進入S 期。
　　 6)細胞中的總Trx-1 水平升高而核內(nèi)Trx-1 水平無變化時，不能影響MCF-7 細胞對順鉑的敏感性。但核內(nèi)Trx-1 水平增加而總TRx-1 水平不變時MCF-7 明顯的表現(xiàn)出對順鉑的抗性增加了。MCF-7 抗性株中的核內(nèi)Trx-1 水平高于敏感株，而且MCF-7細胞用順鉑處理時，順鉑敏感細胞株中核內(nèi)T

7、rx-1 會下降，而順鉑抗性株中核內(nèi)Trx-1的水平?jīng)]有明顯的變化。同時研究發(fā)現(xiàn)，抗癌基因p53的mRNA 水平明顯和核內(nèi)Trx-1 水正相關(guān)。這些結(jié)果說明，核內(nèi)Trx-1是MCF-7 抵抗順鉑誘導(dǎo)的凋亡中所必需的，而可能的機制是核內(nèi)Trx-1 促使抗癌基因p53的表達。
　　 從以上的實驗可以得出如下結(jié)論：乳腺癌病人的血清中Trx-1的濃度和正常人相比略有下降但并不明顯；Trx-1 無論在MCF-7 細胞的體外還是體內(nèi)均可以細