骨橋蛋白介導(dǎo)甲狀腺相關(guān)眼病發(fā)病機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　甲狀腺相關(guān)眼病(thyroid associated ophthalmopathy，TAO)是彌漫性毒性甲狀腺腫(Graves' disease，GD)最常見(jiàn)的甲狀腺外表現(xiàn)，是累及眼眶的一種自身免疫性炎癥性疾病。TAO具體發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，至今仍不十分清楚，目前仍缺乏有效性治療手段。目前證據(jù)表明眼眶成纖維細(xì)胞（orbital fibroblasts，OFs）在TAO發(fā)病機(jī)制中起核心作用，參與TAO眼眶炎癥、組織重塑和纖

2、維化等多種病理過(guò)程。骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)是一種分泌型磷酸化糖蛋白，在一些自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖，并且和組織纖維化有密切關(guān)系，最近研究發(fā)現(xiàn)，GD患者血清中OPN水平明顯增高。為了探究OPN和TAO發(fā)病的關(guān)系，首先擬檢測(cè)TAO眼眶脂肪結(jié)締組織中OPN mRNA和蛋白表達(dá)情況，相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)情況以及和OPN mRNA表達(dá)量之間的關(guān)系。然后進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，用OPN刺激

3、TAO患者來(lái)源OFs，觀察OPN對(duì)OFs增殖、移行以及對(duì)VEGF和CollagenⅠ mRNA表達(dá)量的影響并探究其相關(guān)機(jī)制。
　　方法：
　　1.OPN在TAO患者眼眶脂肪結(jié)締組織中的表達(dá)情況
　　活動(dòng)期或穩(wěn)定期TAO患者行眼眶減壓手術(shù)時(shí)，取眼眶脂肪結(jié)締組織，用行眼整形手術(shù)患者的正常眼眶脂肪結(jié)締組織作為對(duì)照組，每組6例。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR，RT-PCR）法和Western blotting法

4、分別檢測(cè)OPN mRNA和蛋白表達(dá)情況。然后通過(guò)RT-PCR檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子包括CD40L、CollagenⅠ、HAS2、NF-κB、CCL20、CD44、IFN-α和IFN-γ mRNA表達(dá)情況，并和OPN mRNA表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　2.OPN對(duì)TAO患者OFs的影響及其作用機(jī)制探討
　　排除其它免疫性及炎癥性疾病的TAO患者，行眼眶減壓手術(shù)時(shí)，無(wú)菌條件下取眼眶脂肪結(jié)締組織，組織塊法培養(yǎng)OFs細(xì)胞。用OPN(5u

5、M)進(jìn)行預(yù)處理后，采用MTT法觀察OFs增殖速率，并通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察OPN對(duì)OFs移行的影響，再通過(guò)RT-PCR法檢測(cè)OFs的VEGF和CollagenⅠ mRNA表達(dá)量。
　　同法培養(yǎng)OFs細(xì)胞，用PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002(20uM)、MAPK/ERK信號(hào)通路抑制劑PD98059(20uM)、LY294002和PD98059(20uM+20uM)以及OPN單克隆抗體1A12(20μg/ml)分別聯(lián)合OP

6、N對(duì)OFs進(jìn)行預(yù)處理，通過(guò)MTT法、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和RT-PCR法分別觀察對(duì)OFs增殖、移行速率的影響，并檢測(cè)OFs的VEGF和CollagenⅠ mRNA表達(dá)量的變化。
　　結(jié)果：
　　1.活動(dòng)期TAO患者眼眶脂肪結(jié)締組織OPN mRNA和蛋白表達(dá)量及相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量升高
　　活動(dòng)期TAO患者組眼眶脂肪結(jié)締組織中OPN mRNA比穩(wěn)定期TAO患者組和正常對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);OPN

7、蛋白表達(dá)量也明顯增加，和穩(wěn)定期TAO患者OPN蛋白表達(dá)量相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，但和正常對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　活動(dòng)期TAO患者組眼眶脂肪結(jié)締組織中CD40L、CollagenⅠ mRNA表達(dá)量比穩(wěn)定期TAO患者組和正常對(duì)照組高，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05); HAS2 mRNA表達(dá)量也升高，但和穩(wěn)定期TAO患者組和正常對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);活動(dòng)期和穩(wěn)定期TAO患者組

8、CD44 mRNA表達(dá)量均低于正常對(duì)照(P＜0.05)。TAO患者OPN mRNA表達(dá)量和CD40L、CD44、HAS2 mRNA表達(dá)量之間存在明顯的線性相關(guān)關(guān)系(P＜0.05)。
　　2.OPN可促進(jìn)OFs的增殖、移行速率，并增加VEGF和CollagenⅠ mRNA表達(dá)量。
　　經(jīng)過(guò)OPN處理后，OFs增殖和移行速率加快，加入1A12和LY294002后，OFs增殖和移行速率變慢，而加入PD98059后對(duì)這些效應(yīng)無(wú)明顯影

9、響。
　　經(jīng)OPN預(yù)處理后，OFs的VEGF和CollagenⅠ mRNA表達(dá)量明顯增加，加入1A12和LY294002后，VEGF和CollagenⅠ mRNA表達(dá)量降低，加入PD98059后對(duì)兩種基因mRNA表達(dá)量無(wú)明顯影響。
　　結(jié)論：
　　活動(dòng)期TAO患者眼眶脂肪結(jié)締組織OPN mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高，同時(shí)CD40L、CollagenⅠ和HAS2 mRNA表達(dá)量也增加，且CD40L、CD44、HAS2m