吸煙在甲狀腺相關性眼病氧化應激中的作用及機制研究.pdf

1、目的:
　　甲狀腺相關性眼病是眼眶病中較常見的一種，且發(fā)病率逐漸上升，可引起外觀及視功能的損傷，臨床表現多樣，疾病后果嚴重，具體發(fā)病原因不明確，故近年來一直是困擾眼科醫(yī)生的難題。而吸煙被證明是甲狀腺相關性眼病(TAO)的重要危險因素，另外，有研究發(fā)現吸煙與氧化應激存在相關性，而我們已知氧化應激在TAO的疾病過程中發(fā)揮著重要作用。香煙的成分十分復雜，其中公認的毒性成分為尼古丁，目前國內外在其他疾病方面針對吸煙的研究多采用香煙煙霧提取

2、物(CSE)及尼古丁兩種物質為刺激因素，眼眶成纖維細胞作為TAO的最終效應細胞，是近年來TAO相關研究的經典研究模型。故本研究采用原代培養(yǎng)的眼外肌來源眼眶成纖維細胞，研究香煙煙霧提取物及尼古丁作用于TAO患者及正常人眼眶成纖維細胞后，各種氧化應激指標ROS、MDA、8-OHdG的變化，探索香煙煙霧提取物及尼古丁在TAO這一疾病中是否通過氧化應激發(fā)揮作用，其具體的劑量關系，并通過檢測香煙煙霧提取物及尼古丁對于眼眶成纖維細胞NF-kB通路的

3、作用來進一步探索其可能的作用機制。
　　方法:
　　1、取TAO患者及正常人的眼外肌組織，因標本量少故采取組織塊法進行原代培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定傳代的眼眶成纖維細胞，免疫組化的方法鑒定。
　　2、用MTT法檢測香煙煙霧提取物及尼古丁作用于眼眶成纖維細胞24小時及72小時后細胞的活性。
　　3、ELISA法檢測香煙煙霧提取物及尼古丁作用于眼眶成纖維細胞24小時及72小時后8-OHdG指標的變化。
　　4、分光光度計法

4、檢測香煙煙霧提取物及尼古丁作用于眼眶成纖維細胞24小時及72小時后MDA指標的變化。
　　5、酶標儀法檢測香煙煙霧提取物及尼古丁作用于眼眶成纖維細胞24小時后ROS指標的變化
　　6、RT-PCR法檢測香煙煙霧提取物及尼古丁作用于眼眶成纖維細胞24小時后NF-kB相關基因的表達情況。
　　結果:
　　1、本實驗成功通過組織塊法原代培養(yǎng)眼外肌來源的成纖維細胞，能夠穩(wěn)定傳代，且經過鑒定為眼眶成纖維細胞，能夠成功建立細

5、胞系后作為甲狀腺相關性眼病的細胞模型，為后續(xù)試驗提供可能。
　　2、MTT檢測結果顯示24小時刺激，TAO患者眼眶成纖維細胞在CSE刺激下細胞活力下降幅度更大，而在72小時刺激條件下，低濃度和高濃度的尼古丁呈現了相似的殺傷性?？梢娢鼰煹膿p傷作用隨刺激時間的增強呈一定的累積作用。
　　3、在24小時刺激條件下，尼古丁10ug/ml可顯著升高兩種細胞體內8-OHdG的含量;在72小時刺激條件下，CSE單獨刺激和低濃度尼古丁即可引

6、起8-OHdG產生的增加，可見高劑量的尼古丁可在短時間內即可促進8-OHdG含量的突然上升，而低劑量的尼古丁導致8-OHdG的緩慢積累。
　　4、在同時給予CSE和尼古丁10ug/ml刺激之后，MDA含量相比CSE單獨刺激以及陰性對照組均有顯著的增加。在72小時刺激之后，觀察細胞體內MDA含量變化，所有刺激條件對比陰性對照組MDA表達均有大幅度的增加。
　　5、吸煙可通過增加ROS含量發(fā)揮作用。高濃度尼古丁的作用效果最明顯。

7、
　　6、在TAO患者眼眶成纖維細胞中，CSE刺激之后NF-κB RNA水平顯著性上調?？梢娢鼰熗ㄟ^上調NF-κB基因的表達發(fā)揮作用。
　　結論:
　　吸煙可導致眼眶成纖維細胞氧化應激指標MDA、8-OHdG及ROS增高，且尼古丁作為香煙中的主要毒性成分發(fā)揮作用，即使低濃度的尼古丁，也可隨時間累積而發(fā)揮較強的作用，說明吸煙可通過引起氧化應激而參與TAO病理過程。其中可能的分子通路為NF-κB，吸煙可上調NF-κB基因的