GRAVES病小鼠模型及甲狀腺相關(guān)眼病的研究.pdf

1、背景及目的： Graves病(Graves'disease，GD)是常見(jiàn)的器官特異性自身免疫疾病，其發(fā)生的直接原因是機(jī)體產(chǎn)生了針對(duì)促甲狀腺素(TSH)受體(TSHR)的刺激性抗體(TSAb)，從而促進(jìn)甲狀腺素的生成。目前GD的具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，傳統(tǒng)的治療方法不能從根源上阻斷疾病的發(fā)生。而建立GD動(dòng)物模型無(wú)疑是解決上述問(wèn)題的有效手段。近十余年，人們通過(guò)不同方法用TSHR抗原主動(dòng)免疫動(dòng)物產(chǎn)生TSHR抗體(TRAb)，成功建立了

2、甲亢小鼠模型，但是這些建模方法在發(fā)病率，發(fā)病穩(wěn)定性，易感小鼠種系以及臨床表現(xiàn)上都存在較大差別。其中，用表達(dá)TSHR A亞單位的腺病毒(Ad-TSHR-A)免疫雌性BALB/c小鼠建立GD模型是比較穩(wěn)定且成模率較高的造模方法。因此，本研究第一部分利用Ad-TSHR-A免疫BALB/c小鼠建立GD模型，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行GD免疫機(jī)制和新治療方法的探討。 GD可以出現(xiàn)甲狀腺外的器官損害，其中最常見(jiàn)的是甲狀腺相關(guān)眼病(TAO)，占GD患

3、者的25-50％。目前TAO的治療方法主要是激素和球后放療，激素治療方案之間差別很大，而球后放療仍然存在爭(zhēng)議。疾病活動(dòng)度和嚴(yán)重程度決定TAO治療時(shí)機(jī)的選擇，因此，了解TAO嚴(yán)重程度的影響因素對(duì)我們正確評(píng)判疾病的進(jìn)展和選擇治療時(shí)機(jī)很有幫助。同時(shí)，GD和TAO是多基因疾病，遺傳因素和環(huán)境因素在發(fā)病中起著重要作用，一些基因多態(tài)性已被證實(shí)和GD/TAO的發(fā)病有關(guān)。本研究第二部分通過(guò)對(duì)TAO患者的臨床資料進(jìn)行分析，以了解TAO嚴(yán)重程度的影響因素和

4、進(jìn)行不同治療方法的比較，并對(duì)干擾素誘導(dǎo)的解螺旋酶(Interferon-induced helicase，IFIH1)基因多態(tài)性和GD/TAO的相關(guān)性進(jìn)行探討。 研究方法： 1.應(yīng)用Ad-TSHR-A肌注免疫雌性BALB/c小鼠，誘導(dǎo)TRAb生成，進(jìn)而建立GD小鼠模型，并在該模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行以下研究：1)應(yīng)用合成的T細(xì)胞抗原肽刺激小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞探討GD小鼠中Th1/Th2免疫反應(yīng)狀態(tài)；2)采用移植致敏淋巴細(xì)胞的方法以

5、期建立TAO的小鼠模型。3)通過(guò)鼻粘膜給予T細(xì)胞表位肽的方法誘導(dǎo)粘膜耐受以期改善GD病情。4)口服靈芝多糖對(duì)GD小鼠模型的影響及機(jī)制的探討。 2.對(duì)2003年2008年瑞金醫(yī)院就診的TAO患者的臨床資料進(jìn)行回顧性分析，了解TAO嚴(yán)重程度的影響因素；對(duì)接受激素和球后放療的患者進(jìn)行隨訪(fǎng)觀察，以對(duì)比不同治療方案的療效，并分析影響療效的因素。同時(shí)采用單堿基延伸的方法對(duì)IFIH1基因A946T位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性(single nucleo

6、tide polymorphism，SNP)和GD/TAO的相關(guān)性進(jìn)行探討。 結(jié)果： 1.本研究運(yùn)用Ad-TSHR-A免疫雌性BALB/c小鼠成功建立了GD小鼠模型，甲亢小鼠表現(xiàn)為血清T4和TRAb增高，小鼠在第三次免疫后4周，低免疫劑量組和高免疫劑量組分別有5/6只和4/6只小鼠發(fā)生了甲亢。甲亢小鼠出現(xiàn)肝臟損害，且血清ALT，ALP和血清T4水平呈正相關(guān)。眼病的發(fā)生率很低，42只免疫小鼠中僅有2只出現(xiàn)了眼部的改變。

7、 利用合成的T細(xì)胞表位肽(PA多肽)刺激Ad-TSHR-A免疫小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞，結(jié)果IFN-γ生成明顯增高，而IL-4沒(méi)有明顯改變，提示該建模方法中Th1免疫反應(yīng)可能發(fā)揮重要作用。移植GD小鼠的脾臟細(xì)胞，受體小鼠沒(méi)有發(fā)生血清T4和TRAb的改變，也無(wú)TAO的發(fā)生。通過(guò)鼻粘膜預(yù)先用PA多肽免疫小鼠，結(jié)果抗原特異性淋巴細(xì)胞反應(yīng)中，IFN-γ生成減少，但是GD小鼠血清T4和TRAb都沒(méi)有明顯改變。 高劑量靈芝多糖干預(yù)下， GD小

8、鼠的血清T4和TRAb水平都有增高，但是沒(méi)有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(PT4=0.065，PTRAb=0.052)。高劑量靈芝多糖可以增加免疫小鼠的抗原特異性淋巴細(xì)胞反應(yīng)中IFN-γ生成，同時(shí)促進(jìn)小鼠脾臟貼壁細(xì)胞生成IL-12，提示靈芝多糖可以促進(jìn)Th1，特別是抗原特異性Th1免疫反應(yīng)。靈芝多糖干預(yù)下，小鼠肝酶指標(biāo)下降。 2.TAO患者資料分析中，發(fā)病年齡大，吸煙的患者眼病病情更為嚴(yán)重；有家族史的患者發(fā)病年齡明顯小于無(wú)家族史者。在治療方法

9、的比較中，靜脈甲強(qiáng)龍的療效最高，而球后放療療效最差，但后者仍可有效降低TAO的活動(dòng)性。 在中國(guó)上海地區(qū)的人群中未發(fā)現(xiàn)IFIH1基因A946T SNP等位基因頻率和基因型頻率在GD和正常人，TAO和正常人，以及有無(wú)眼病的GD患者中均沒(méi)有顯著差別。 結(jié)論： 1.Ad-TSHR-A免疫雌性BALB/c小鼠成功建立了GD小鼠模型，該模型中，肝損發(fā)生率較高，但眼病發(fā)生率很低。 2.Th1免疫反應(yīng)在GD發(fā)生中起著重要

10、作用。通過(guò)移植GD小鼠的致敏淋巴細(xì)胞的方法不能建立TAO模型。PA多肽粘膜免疫不能有效抑制GD的發(fā)生。 3.靈芝多糖可能加重GD小鼠的甲亢狀態(tài)，但可以改善GD引起的肝臟損害。 4.患者的發(fā)病年齡和是否吸煙是影響GO嚴(yán)重程度的主要因素，而有無(wú)家族史則會(huì)影響到TAO的發(fā)病年齡。 5.激素是TAO有效的治療方法，靜脈甲強(qiáng)龍療效最好；球后放療療效較差，但仍可有效降低TAO的活動(dòng)性。 6.在中國(guó)上海地區(qū)的人群中，I