PERK介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在Cx43調(diào)控頸椎后縱韌帶骨化過(guò)程中的作用研究.pdf

1、目的：頸椎后縱韌帶骨化癥(OPLL)好發(fā)于65歲以上的東亞人群，其特點(diǎn)表現(xiàn)為后縱韌帶的增生、肥厚和骨化，伴隨著骨化的進(jìn)展，可逐漸加重椎管狹窄以及脊髓和神經(jīng)根受壓的程度，進(jìn)而出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)受損表現(xiàn)，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。目前尚無(wú)療效滿意的保守療法，如果癥狀嚴(yán)重，患者最終會(huì)選擇手術(shù)治療，但也存在一些問(wèn)題，比如風(fēng)險(xiǎn)較高;易出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥;手術(shù)療效對(duì)于有些患者而言并不確切。因此目前的研究重點(diǎn)是探尋其發(fā)病機(jī)制。經(jīng)過(guò)多年的研究，遺傳、微環(huán)境、代謝

2、、力學(xué)改變等學(xué)說(shuō)被廣為接受，但這些尚難以解釋其完整的發(fā)病機(jī)理，需要更進(jìn)一步探索。①近年來(lái)有研究顯示，PERK介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)是人體內(nèi)成骨作用、骨形成不可或缺的重要機(jī)制，且可在機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)牙周韌帶細(xì)胞骨化過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用，但對(duì)于頸椎后縱韌帶骨化的影響尚無(wú)報(bào)道，需要我們?nèi)ヲ?yàn)證該現(xiàn)象在機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)OPLL過(guò)程中的作用機(jī)制。②在我們的既往研究中發(fā)現(xiàn)，OPLL患者后縱韌帶細(xì)胞表達(dá)Cx43要明顯高于非骨化患者，而且初步證實(shí)在頸椎后縱韌帶

3、骨化的過(guò)程中，Cx43可能發(fā)揮了重要的調(diào)控作用;目前研究發(fā)現(xiàn)Cx43可通過(guò)ERK調(diào)節(jié)成骨、軟骨細(xì)胞代謝，且Src/MEK/ERK通路與OPLL發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，因此需要探討Cx43是否可通過(guò)MAPK相關(guān)通路調(diào)控OPLL。③有文獻(xiàn)報(bào)道在某些病理過(guò)程中，Cx43可通過(guò)ERS發(fā)揮相應(yīng)的調(diào)節(jié)作用;且ERS可激活MAPK家族信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的各種生命活動(dòng)。明確在應(yīng)力刺激作用下，Cx43是否可通過(guò)PERK介導(dǎo)的ERS激活MAPK信號(hào)通路，進(jìn)而

4、調(diào)控骨化，有利于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)OPLL的發(fā)病機(jī)制。
　　方法：自2015年12月至2017年6月，16名頸椎后縱韌帶骨化和24名非骨化患者，均采取頸椎前路減壓（經(jīng)椎間隙或椎體次全切除）植骨融合內(nèi)固定術(shù)，術(shù)中收取大塊后縱韌帶組織標(biāo)本，盡量避免使用槍狀咬骨鉗嵌壓韌帶組織。采取酶消化法分離、培養(yǎng)韌帶細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞內(nèi)波狀蛋白進(jìn)行免疫組化染色以鑒定后縱韌帶細(xì)胞，并進(jìn)行后續(xù)分子生物學(xué)研究。具體步驟為:①取第3代骨化和非骨化組韌帶細(xì)胞，采用RT-PC

5、R檢測(cè)mRNA水平的表達(dá)，Western-blotting檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)，比較兩組間PERK、CHOP、GRP78等ERS相關(guān)指標(biāo)和ALP、OCN、COLⅠ等成骨標(biāo)志物的表達(dá)差異;采用Flexercell應(yīng)力加載系統(tǒng)對(duì)非骨化組細(xì)胞施加應(yīng)力刺激，比較刺激前后上述指標(biāo)及流式細(xì)胞儀檢測(cè)活性氧(ROS)水平的改變;用PERK通路特異性抑制劑抑制非骨化組細(xì)胞的ERS，再予以應(yīng)力刺激，觀察各項(xiàng)成骨標(biāo)志物的表達(dá)變化。②利用免疫組化法比較骨化組和非

6、骨化組韌帶細(xì)胞內(nèi)p38MAPK、ERK1/2和JNK等MAPK相關(guān)指標(biāo)的磷酸化水平，Western-blotting檢測(cè)應(yīng)力刺激對(duì)上述指標(biāo)在非骨化組細(xì)胞內(nèi)磷酸化程度的影響;制備Cx43的siRNA序列，采用慢病毒攜帶此序列轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分別從基因及蛋白表達(dá)水平檢驗(yàn)其抑制效率，并進(jìn)一步觀察干擾Cx43對(duì)于機(jī)械應(yīng)力激活MAPK通路的影響;依次干擾Cx43和特異性抑制p38MAPK、ERK1/2、JNK各通路后，檢測(cè)應(yīng)力刺激下各項(xiàng)成骨標(biāo)志物的基因

7、表達(dá)。③干擾非骨化組細(xì)胞內(nèi)的Cx43后予以應(yīng)力刺激，檢測(cè)PERK、CHOP、GRP78的表達(dá)以及ROS水平，再過(guò)表達(dá)Cx43，觀察上述指標(biāo)的變化;觀察抑制PERK介導(dǎo)的ERS對(duì)于機(jī)械應(yīng)力激活MAPK通路的影響;在機(jī)械應(yīng)力加載模型的基礎(chǔ)上，依次用siRNA/Cx43和PERK通路特異性激活劑處理非骨化患者的韌帶細(xì)胞，檢測(cè)MAPK相關(guān)指標(biāo)的磷酸化程度和成骨標(biāo)志物的表達(dá)。
　　結(jié)果：利用酶消化法培養(yǎng)第3代細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，形態(tài)穩(wěn)定，排列

8、有序;主要以長(zhǎng)梭形和多角形為主，胞體豐富，呈放射狀、旋渦狀生長(zhǎng)。骨化組及非骨化組細(xì)胞形狀無(wú)明顯區(qū)別。對(duì)波形蛋白采取免疫組化染色呈陽(yáng)性，證實(shí)了其成纖維細(xì)胞性質(zhì)。①通過(guò)檢測(cè)PERK、CHOP、GRP78等ERS相關(guān)指標(biāo)和ALP、OCN、COLⅠ等成骨標(biāo)志物在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)骨化組均明顯高于非骨化組，差異顯著(p＜0.05);對(duì)非骨化患者的韌帶細(xì)胞施加應(yīng)力刺激，發(fā)現(xiàn)上述指標(biāo)的表達(dá)明顯上調(diào)，且流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS水平升高，與刺激前

9、相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);抑制PERK介導(dǎo)的ERS可顯著下調(diào)應(yīng)力刺激誘導(dǎo)的成骨標(biāo)志物的表達(dá)(p＜0.05)。②免疫組化檢測(cè)p38MAPK、ERK1/2和JNK等MAPK相關(guān)指標(biāo)的磷酸化蛋白在骨化及非骨化組韌帶中均有表達(dá)，但骨化組明顯強(qiáng)于非骨化組;機(jī)械應(yīng)力刺激非骨化患者的韌帶細(xì)胞后，WB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)上述指標(biāo)的磷酸化蛋白含量明顯升高(p＜0.05);成功構(gòu)建了Cx43的siRNA，從mRNA及蛋白水平進(jìn)行評(píng)價(jià)其抑制效率均大于70％;

10、干擾非骨化組韌帶細(xì)胞的Cx43可明顯抑制機(jī)械應(yīng)力激活MAPK通路(p＜0.05);干擾Cx43及特異性抑制p38MAPK、ERK1/2通路可明顯下調(diào)機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)COLⅠ、OCN、ALP和Runx2等成骨標(biāo)志物的表達(dá)(p＜0.05)，但在JNK通路抑制組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，提示在OPLL過(guò)程中JNK通路的作用不顯著。③干擾非骨化組韌帶細(xì)胞內(nèi)的Cx43可明顯下調(diào)應(yīng)力刺激誘導(dǎo)PERK、CHOP、GRP78的表達(dá)以及ROS水平(p

11、＜0.05)，過(guò)表達(dá)Cx43后發(fā)現(xiàn)ERS相關(guān)指標(biāo)及ROS水平均出現(xiàn)顯著上調(diào);抑制PERK介導(dǎo)的ERS可顯著抑制機(jī)械應(yīng)力激活MAPK通路(p＜0.05);在干擾Cx43的前提下，非骨化組韌帶細(xì)胞MAPK磷酸化和成骨分化受到抑制，再次激活PERK介導(dǎo)的ERS可以恢復(fù)機(jī)械應(yīng)力對(duì)MAPK通路的激活以及成骨刺激作用。
　　結(jié)論：利用酶消化法可以在體外環(huán)境中成功分離、培養(yǎng)后縱韌帶組織細(xì)胞，并可通過(guò)波形蛋白染色證實(shí)其來(lái)源。①機(jī)械應(yīng)力可刺激后縱韌