白細(xì)胞介素-17A及骨橋蛋白在肺結(jié)核治療過(guò)程中免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究.pdf

1、研究背景與實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，M.TB)感染引起的傳染性疾病，TB的發(fā)生和發(fā)展與患者的免疫功能，尤其是細(xì)胞免疫功能密切相關(guān)，其中主要效應(yīng)細(xì)胞為T淋巴細(xì)胞。CD4幼稚細(xì)胞可分化為Th1、Th2和Th17亞群，IL-17為Th17細(xì)胞分泌的主要的細(xì)胞因子。有研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)核性胸水，肺結(jié)核支氣管灌洗液和外周血中可檢測(cè)到IL-17

2、mRNA的表達(dá)，提示Th17細(xì)胞及IL-17參與了結(jié)核的病理過(guò)程。而在許多功能上，Th17細(xì)胞同調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Regulatory T cell，Treg)密切相關(guān)，控制著體內(nèi)自身免疫反應(yīng)，在免疫耐受和動(dòng)態(tài)平衡中起中心作用。Treg細(xì)胞數(shù)量和功能出現(xiàn)受損，免疫耐受就被打破。在許多慢性炎癥，包括結(jié)核感染引起的慢性炎癥中，IL-17和IFN-γ相互作用可以引起病理性損傷。
　　骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)屬于細(xì)胞外基

3、質(zhì)蛋白，是可溶性的磷酸化糖蛋白。有研究發(fā)現(xiàn)，OPN可以作為細(xì)胞因子的一種參與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肝炎、肝癌等多種疾病的發(fā)生發(fā)展。另外，OPN可通過(guò)增加IL-12和IFN-γ分泌而加重結(jié)核桿菌感染后肺部的病理性損傷。體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞株，感染結(jié)核桿菌之后，OPN在培養(yǎng)上清中的水平大幅度增加。這些表明OPN可能參與了TB的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。
　　Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞、Th17和Treg細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子以及OPN對(duì)于結(jié)核感染的發(fā)生、發(fā)展及

4、預(yù)后都有重要意義，但目前關(guān)于療效和預(yù)后的動(dòng)態(tài)觀察報(bào)道較少，而且Th17細(xì)胞、IL-17、Treg細(xì)胞在肺結(jié)核發(fā)病過(guò)程中的作用尚存在爭(zhēng)議。本課題將通過(guò)觀察和分析初治痰涂片抗酸染色(Acid Fast Bacilli-smear, AFB)陽(yáng)性的肺結(jié)核患者和經(jīng)抗結(jié)核治療AFB轉(zhuǎn)陰后外周血IL-17、IL-23、IL-6、IFN-γ、IL-10、OPN、IP-10的水平，以及Treg細(xì)胞在治療過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化，進(jìn)一步闡明肺結(jié)核治療過(guò)程中細(xì)胞免

5、疫的特征的變化，并探索其中的機(jī)制，同時(shí)找出評(píng)價(jià)肺結(jié)核治療效果的可靠指標(biāo)。
　　研究方法:
　　收集、整理和分析20例AFB陽(yáng)性的肺結(jié)核患者的臨床資料和樣本，以及對(duì)應(yīng)的20例健康者的資料和樣本。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)20例AFB陽(yáng)性肺結(jié)核患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)中T淋巴細(xì)胞、Treg細(xì)胞的比例，以及產(chǎn)生IL-17A細(xì)胞的類型和比例，酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)(Enzyme-linked Immunospot Assay，ELISPO

6、T)檢測(cè)產(chǎn)生IL-17A的細(xì)胞數(shù)量，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA)檢測(cè)20例AFB陽(yáng)性肺結(jié)核患者治療前后體內(nèi)細(xì)胞因子IL-17A、IL-23、IL-6、IFN-γ、 IL-10，以及OPN、IP-10的水平。同樣的方法檢測(cè)對(duì)應(yīng)的20例健康者相應(yīng)指標(biāo)的水平。
　　體外培養(yǎng)肺泡上皮細(xì)胞株(A549)，加入BCG、IL-17A、IL-10、OPN等刺激，觀察細(xì)胞株的變化，

7、ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中細(xì)胞和因子乳酸脫氫酶(LactateDehydrogenase，LDH)的水平，研究IL-17A、IL-10、OPN等在結(jié)核的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的不同作用，并探索其中可能的機(jī)制。
　　體外培養(yǎng)健康者和肺結(jié)核患者PBMC，在BCG和OPN等刺激后24h，ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的水平。
　　研究結(jié)果:
　　第一部分:
　　AFB陽(yáng)性患者表達(dá)IL-17A的能力較健康對(duì)照組明顯增加，而

8、經(jīng)抗結(jié)核治療，痰涂片轉(zhuǎn)陰后，患者IL-17A的水平雖明顯下降，但是仍然高于健康對(duì)照的水平。同時(shí)與健康對(duì)照組比較，AFB陽(yáng)性患者表達(dá)IL-23、IL-6、IFN-γ的能力亦顯著增加。流式細(xì)胞技術(shù)分析，在AFB陽(yáng)性的患者中產(chǎn)生IL-17A細(xì)胞類型除了經(jīng)典T細(xì)胞(CD3+CD56-)外，CD3+CD56+ NKT like細(xì)胞是另一個(gè)主要來(lái)源。Treg細(xì)胞以及其分泌的細(xì)胞因子IL-10能夠抑制Th17細(xì)胞分泌IL-17A。IL-17A與血液中

9、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)和紅細(xì)胞沉降率(Erythrocyte SedimentationRate，ESR)呈正相關(guān)，而與IL-10呈負(fù)相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IL-17A能夠誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞株的凋亡增加，而且能夠加重BCG引起的肺泡上皮細(xì)胞損傷，而IL-10能夠抑制IL-17A對(duì)肺泡上皮細(xì)胞的損傷作用。
　　第二部分:
　　OPN血漿中的水平在AFB陽(yáng)性的患者中較健康對(duì)照組明顯的升高，AFB轉(zhuǎn)陰

10、后又明顯的下降，AFB陽(yáng)性合并結(jié)核性胸水(TPE)患者OPN的表達(dá)水平明顯高于AFB陽(yáng)性未合并TPE的患者的水平。并且OPN與CRP呈明顯正相關(guān)。OPN能夠促進(jìn)γ干擾素誘導(dǎo)蛋白10(IFN-γ-induced protein10，IP-10)的表達(dá)，IP-10在痰涂片陽(yáng)性的患者中表達(dá)也明顯的升高。OPN和IP-10只有在痰涂片轉(zhuǎn)陰后才有明顯的下降。同時(shí)，BCG能夠促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞分泌OPN，而OPN能夠促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞分泌IP-10，同

11、樣的OPN能夠促進(jìn)健康者和肺結(jié)核患者PBMC產(chǎn)生IP-10、IL-12、IFN-γ，而加入IFN-γ中和抗體后，PBMC分泌IP-10和IL-12的能力顯著降低。
　　結(jié)論:
　　在結(jié)核分枝桿菌感染過(guò)程中，IL-17A能夠誘導(dǎo)肺損傷，CD3+CD56+ NKT like細(xì)胞為AFB陽(yáng)性的肺結(jié)核患者IL-17A的重要來(lái)源。在結(jié)核的發(fā)展過(guò)程中，Treg細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子IL-10可以抑制IL-17A引起的肺損傷。OPN能夠誘