骨橋蛋白(OPN)在人卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲過(guò)程中的作用研究.pdf

1、卵巢癌是女性常見(jiàn)的腫瘤之一,其發(fā)病率僅次于子宮癌和子宮頸癌,而列居第三位.但因卵巢癌致死者,卻占各類(lèi)婦科腫瘤的首位,嚴(yán)重威脅著女性生命健康.因此防治卵巢癌的研究正日益受到重視,而預(yù)防卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移則是抵抗卵巢癌行之有效的治療手段.
　　骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)是一種多功能的胞外基質(zhì)蛋白,通過(guò)與細(xì)胞表面的整合素受體αvβ3及CD44受體結(jié)合,介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的粘附、侵襲及轉(zhuǎn)移.這樣,骨橋蛋白在癌癥發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用

2、,就預(yù)示著OPN可能成為惡性腫瘤治療的一個(gè)新靶點(diǎn),而阻斷OPN與其受體的信號(hào)傳導(dǎo)可能為腫瘤治療提供新的生物學(xué)依據(jù).
　　本研究針對(duì)OPN設(shè)計(jì)出三對(duì)siRNA,即人OPN mRNA255位點(diǎn)、483位點(diǎn)、831位點(diǎn),并構(gòu)建表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo-shOPN,同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照pGPU6/GFP/Neo-shNC,運(yùn)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將其轉(zhuǎn)入細(xì)胞中,通過(guò)熒光顯微鏡觀察瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率為60％.通過(guò)G418成功篩

3、選出7個(gè)陽(yáng)性克隆株.利用ELISA進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)OPN被沉默后表達(dá)下降,從而篩選出表達(dá) OPN蛋白最低的單克隆細(xì)胞株,即pGPU6/GFP/Neo-OPN1-3(M1-3細(xì)胞),此單克隆細(xì)胞為255位點(diǎn)構(gòu)建的表達(dá)載體導(dǎo)入的細(xì)胞.應(yīng)用細(xì)胞熒光免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)OPN的表達(dá)情況,結(jié)果顯示OPN被沉默后紅色熒光減弱,說(shuō)明OPN表達(dá)下降,從而證實(shí)OPN基因沉默穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株構(gòu)建成功.
　　本論文通過(guò)細(xì)胞表型實(shí)驗(yàn):MTT細(xì)胞增殖活力分析、軟瓊

4、脂克隆形成實(shí)驗(yàn)、創(chuàng)口愈合實(shí)驗(yàn)、基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)對(duì)7個(gè)陽(yáng)性克隆株進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn):實(shí)驗(yàn)組M1-3(pGPU6/GFP/Neo-OPN1-3)同對(duì)照組MC(HO-8910PM未處理組)相比,細(xì)胞增殖活力、克隆形成數(shù)量、轉(zhuǎn)移侵襲能力均明顯降低,且差異顯著.說(shuō)明OPN被沉默后人卵巢癌細(xì)胞的增殖侵襲轉(zhuǎn)移能力減弱.因此,成功篩選出M1-3(OPN被沉默的HO-8910PM)細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。
　　有證據(jù)顯示 TLRs表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞表面.通過(guò)

5、TLR4特異的激動(dòng)劑細(xì)菌脂多糖LPS刺激腫瘤細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲.然而骨橋蛋白OPN亦能增強(qiáng)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移,那么TLR4信號(hào)與OPN表達(dá)是否有某種聯(lián)系?
　　基于上述疑問(wèn),接著本研究通過(guò)使用TLR4特異的激動(dòng)劑LPS刺激MC(HO-8910PM細(xì)胞)和M1-3(OPN被沉默的HO-8910PM細(xì)胞),通過(guò)MTT增殖活力實(shí)驗(yàn)、創(chuàng)口愈合實(shí)驗(yàn)、基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)實(shí)驗(yàn)組M1-3(OPN被敲低的HO-8910PM細(xì)胞

6、)同對(duì)照組MC(HO-8910PM細(xì)胞)相比,細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移及侵襲能力明顯降低,說(shuō)明OPN被沉默后降低了人卵巢癌HO-8910PM細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲能力.(2)MC和M1-3細(xì)胞經(jīng)LPS處理6h后,與正常組(未加LPS處理組)相比,細(xì)胞轉(zhuǎn)移及侵襲能力均表現(xiàn)出升高,且M1-3比MC細(xì)胞轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移侵襲能力增強(qiáng)的程度低,說(shuō)明OPN沉默能影響LPS促使的人卵巢癌細(xì)胞HO-8910PM的轉(zhuǎn)移及侵襲.從而能證實(shí)LPS通過(guò)上調(diào)OPN的表達(dá)來(lái)促進(jìn)HO-

7、8910PM細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及侵襲.
　　利用ELISA實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞熒光免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LPS刺激OPN基因沉默人卵巢癌的OPN表達(dá)情況,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:(1)M1-3(OPN被沉默的細(xì)胞)比MC(HO-8910PM) OPN表達(dá)明顯減少,且差異顯著.(2)MC和M1-3細(xì)胞經(jīng)LPS處理6h后,均比正常組(未用LPS處理)OPN表達(dá)升高,且M1-3(OPN被沉默的細(xì)胞)比MC細(xì)胞OPN表達(dá)升高的程度低.說(shuō)明OPN沉默影響LPS促使的人卵巢癌