哮喘和變應(yīng)性鼻炎中線粒體氧化呼吸鏈和活性氧的研究.pdf

1、第一部分哮喘患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中線粒體氧化呼吸鏈和活性氧的研究
　　背景和目的：哮喘是一項(xiàng)世界性的健康問題。氧化應(yīng)激在哮喘的發(fā)病中起著重要作用，當(dāng)氣道暴露于各種煙塵、污染物、變應(yīng)原的環(huán)境時(shí)，這些刺激物刺激上皮細(xì)胞線粒體導(dǎo)致氧化損害，打破了氧化和抗氧化的平衡，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，最終引發(fā)氣道炎癥。有研究提示氧化應(yīng)激的增加會(huì)導(dǎo)致上皮炎性細(xì)胞激活并致活性氧（ROS）生成，而線粒體呼吸鏈又是生物活性氧（ROS）的主要來源。本研究擬以骨骼肌線粒

2、體呼吸鏈激活路徑為基礎(chǔ)，建立PBMC線粒體氧化呼吸鏈功能的檢測(cè)方法，通過電子順磁共振技術(shù)直接檢測(cè)哮喘控制和未控制患者活性氧（ROS）釋出及線粒體氧化呼吸鏈活性，來評(píng)估氧化應(yīng)激和外周全血ROS與哮喘控制程度的相關(guān)性。
　　方法：(1)外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體呼吸鏈檢測(cè)方法建立：選取18到45歲男女健康志愿者共20（n=20）人，使用高分辨率呼吸運(yùn)動(dòng)計(jì)量?jī)x，在同等條件下，比較兩種線粒體復(fù)合物I激活劑的活性，并以骨骼肌線粒體呼吸鏈激活路徑

3、為模板，建立人PBMC線粒體呼吸鏈氧通量的檢測(cè)方法。(2)哮喘患者外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體呼吸鏈及 ROS的研究：選取18到45歲男女志愿者共36人分為三組，正常對(duì)照組14人（n=14），哮喘控制組11人（n=11），哮喘未控制組11人（n=11）。使用多功能細(xì)胞呼吸代謝生理監(jiān)測(cè)分析儀，測(cè)量外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體氧化呼吸鏈氧通量，運(yùn)用電子順磁共振（EPR）測(cè)量外周血氧活性氧（ROS）產(chǎn)出量。
　　結(jié)果：(1)外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體呼

4、吸鏈檢測(cè)方法建立：丙酮酸鹽+蘋果酸鹽組合（pyruvate+ malate）和谷氨酸鹽+蘋果酸鹽組合（glutamate+ malate）這兩組復(fù)合物 I的激活劑在正常人群?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞線粒體氧化呼吸鏈中的作用類似。成功建立人PBMC線粒體呼吸鏈氧通量的檢測(cè)方法。(2)哮喘患者外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體呼吸鏈及 ROS的研究：哮喘未控制組外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體氧化呼吸中各階段氧通量較正常對(duì)照組有不同程度下降。哮喘未控制VADP段氧通量較正常對(duì)照

5、組明顯下降（6.6±1.0 vs10.1±1.1 pmol/s/10^6cell，*p<0.05）。反映線粒體氧化磷酸化的耦合程度的ACR值（Vmax/V0，基礎(chǔ)代謝狀態(tài)）未顯示明顯差異（3.2±0.3 vs3.3±0.2 vs3.8±0.8）。哮喘未控制組 ROS的生成與正常對(duì)照組相比顯著增高（0.7±0.04 vs0.5±0.03μmol/min,*p<0.05）。
　　結(jié)論：(1)丙酮酸鹽+蘋果酸鹽組合（pyruvate+

6、malate）和谷氨酸鹽+蘋果酸鹽組合（glutamate+ malate）均可作為復(fù)合物 I的激活劑用于人外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體的研究。在線粒體氧化呼吸鏈中不同的激發(fā)路徑可能會(huì)影響復(fù)合物活性的發(fā)揮。(2)線粒體氧化呼吸鏈的功能與哮喘的控制程度相關(guān)，哮喘控制程度越低可能線粒體氧化呼吸鏈功能越弱。
　　第二部分鼻粘膜激發(fā)實(shí)驗(yàn)中線粒體呼吸鏈氧通量和活性氧的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)及與嗜酸性粒細(xì)胞的相關(guān)性研究
　　背景和目的：變應(yīng)性鼻炎是一種常見

7、的呼吸道變應(yīng)性疾病，大量研究表明，變應(yīng)性鼻炎與哮喘在病因、發(fā)病機(jī)制和病理生理改變等方面有著相同或相似的表現(xiàn)。我們?cè)诘谝徊糠值难芯刻崾狙趸瘧?yīng)激和活性氧（ROS）在哮喘發(fā)病過程中可能發(fā)揮重要作用。本部分研究擬通過鼻粘膜激發(fā)試驗(yàn)?zāi)M出變應(yīng)性鼻炎發(fā)作的動(dòng)態(tài)條件，通過檢測(cè)患者外周血活性氧（ROS）釋出量及 PBMC線粒體氧化呼吸鏈氧通量，來探討氧化應(yīng)激和活性氧（ROS）在變應(yīng)性鼻炎發(fā)病中的變化。
　　方法：本研究選取11位18到55歲對(duì)牧草

8、花粉過敏的變應(yīng)性鼻炎患者，每位參與者隨機(jī)參與兩次花粉鼻粘膜激發(fā)試驗(yàn)（激發(fā)物和安慰劑）。并于激發(fā)前（t0）和激發(fā)后6小時(shí)（t6）及24小時(shí)（t24）收集鼻粘膜灌洗液及外周靜脈血，流式細(xì)胞術(shù)分析鼻粘膜灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞含量，顯微鏡下分析外周嗜酸性粒細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，使用多功能細(xì)胞呼吸代謝生理監(jiān)測(cè)分析儀測(cè)量外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體氧化呼吸鏈氧通量，運(yùn)用電子順磁共振（EPR）測(cè)量外周血活性氧（ROS）產(chǎn)出量。
　　結(jié)果：牧草花粉鼻粘膜激發(fā)后2

9、4小時(shí)內(nèi)，11名受試者鼻腔灌洗液和外周靜脈血中嗜酸性粒細(xì)胞百分比均持續(xù)上升。變應(yīng)原激發(fā)6小時(shí)后（t6），外周血單核細(xì)胞線粒體氧化呼吸鏈VADP段氧通量較t0和t24顯著降低(2.1±0.4 vs4.7±0.9 pmol/s*mill,*p<0.05；2.1±0.4 vs6.2±0.7 pmol/s*mill,*p<0.01)，提示線粒體功能損害。變應(yīng)原激發(fā)6小時(shí)后線粒體氧化磷酸化的耦合程度的ACR值（Vmax/V0，基礎(chǔ)代謝狀態(tài)）顯著低

10、于激發(fā)后24小時(shí)（1.8±0.3 vs3.9±0.7,*p<0.05）。并且VADP段氧通量與外周靜脈血嗜酸性粒細(xì)胞百分比呈顯著負(fù)相關(guān)（R2=0.40,*p<0.05），與鼻腔灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞百分比沒有相關(guān)性。而激發(fā)前后外周血ROS的析出未有明顯差異。
　　結(jié)論：經(jīng)變應(yīng)原鼻激發(fā)6小時(shí)后，外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體呼吸鏈功能受損。外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體復(fù)合物 I功能障礙可能參與變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病過程。經(jīng)變應(yīng)原激發(fā)后PBMC線粒體功能損