線粒體呼吸鏈與高氧肺損傷.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：高氧暴露所致線粒體呼吸鏈功能障礙與高氧肺損傷關(guān)系的研究
　　 實(shí)驗(yàn)一：高氧暴露對早產(chǎn)新生大鼠肺組織線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅲ、Ⅴ表達(dá)的影響
　　 目的：研究高濃度氧暴露對早產(chǎn)新生大鼠肺組織線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅲ、Ⅴ動(dòng)態(tài)表達(dá)的影響。探討高濃度氧暴露所導(dǎo)致的線粒體呼吸鏈功能障礙與高氧肺損傷的關(guān)系。
　　 方法：參照本研究室前期研究建立的早產(chǎn)鼠高氧肺損傷模型。早產(chǎn)新生SD大鼠生后

2、1d隨機(jī)分為空氣組、高氧組。高氧組持續(xù)暴露于常壓氧艙中，氧濃度為85%；空氣組置于同一室常壓空氣中。兩組分別于高氧或空氣暴露后1、4、7、10和14d提取肺組織總RNA和蛋白，采取半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)測定Cytb、ATPase6，8 mRNA水平的動(dòng)態(tài)表達(dá)；同時(shí)應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測肺組織切片中Cytb蛋白分布和表達(dá)；應(yīng)用Western blot檢測肺組織Cytb蛋白水平的動(dòng)態(tài)表達(dá)。
　　 結(jié)果：(1)與空氣組相比，高氧暴

3、露1、4d Cytb mRNA含量及其表達(dá)顯著增強(qiáng)；7d后Cytb呈下降趨勢，其表達(dá)較空氣組減弱，但兩者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨日齡變化高氧暴露后，肺組織Cytb免疫組織化學(xué)結(jié)果與Cytb mRNA表達(dá)相似。
　　 (2)Western blot結(jié)果顯示，與空氣組相比，高氧暴露1、4d肺組織Cytb蛋白表達(dá)增強(qiáng)但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；7d后Cytb呈逐漸下降趨勢，其表達(dá)較空氣組減弱,但7、10d兩者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，14d極顯著

4、減弱。
　　 (3)與空氣組相比，高氧暴露1d時(shí)ATPase6 mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)，4d雖仍增強(qiáng)，但兩者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，7、10d時(shí)減弱，但兩者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，14d又出現(xiàn)極顯著增強(qiáng)；與空氣組相比，高氧暴露1、4d時(shí)ATPase8 mRNA表達(dá)減弱，但兩者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，7d后開始出現(xiàn)增強(qiáng)，7、14d時(shí)顯著增強(qiáng)，10d時(shí)雖仍增強(qiáng)，但兩者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：高氧暴露誘導(dǎo)線粒體呼吸鏈酶復(fù)合

5、體Ⅲ、Ⅴ表達(dá)水平的改變，可能導(dǎo)致線粒體呼吸鏈氧化磷酸化解偶聯(lián)、“電子漏”產(chǎn)生ROS引起氧化應(yīng)激和能量代謝障礙，這些變化共同參與高氧肺損傷的發(fā)生發(fā)展過程，因此，高濃度氧暴露所導(dǎo)致的線粒體呼吸鏈功能障礙可能在高氧肺損傷的發(fā)病過程中起重要作用。
　　 實(shí)驗(yàn)二：高氧暴露對人肺腺癌A549細(xì)胞線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ、Ⅳ表達(dá)的影響
　　 目的：研究高濃度氧暴露對人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞來源的肺腺癌A549細(xì)胞線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ、Ⅳ動(dòng)態(tài)

6、表達(dá)的影響。探討高濃度氧暴露所導(dǎo)致的線粒體呼吸鏈功能障礙與高氧肺損傷的關(guān)系。
　　 方法：體外傳代培養(yǎng) A549細(xì)胞系，待其在37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中生長至接近亞匯合狀態(tài)時(shí)，隨機(jī)分為高氧組和空氣組。高氧組持續(xù)暴露于常壓高濃度氧中，氧濃度＞90%，CO2濃度為5%；空氣組仍置于含5% CO2培養(yǎng)箱中。兩組分別于高氧或空氣暴露12、24、48 h 提取A549細(xì)胞總RNA,采取半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)測定ND1、COXⅠ mRN

7、A的表達(dá)。
　　 結(jié)果：(1)與同時(shí)間點(diǎn)空氣組相比，高氧暴露12h A549細(xì)胞ND1 mRNA的表達(dá)增強(qiáng)，但兩者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；高氧組24h ND1 mRNA的表達(dá)顯著減弱；高氧組48h ND1 mRNA的表達(dá)減弱，但兩者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (2)與同時(shí)間點(diǎn)空氣組相比，高氧暴露12h A549細(xì)胞COXⅠ mRNA的表達(dá)增強(qiáng)，但兩者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；高氧暴露24、48h COXⅠ mRNA的表達(dá)顯著

8、增強(qiáng)，高氧暴露24h 以后COXⅠ mRNA的表達(dá)雖比空氣組增強(qiáng)，但呈下降趨勢。
　　 結(jié)論：高氧暴露誘導(dǎo)A549細(xì)胞線粒體呼吸鏈ND1、COXⅠ表達(dá)水平的改變，提示高氧暴露所致的線粒體呼吸鏈功能障礙可能在高氧肺損傷的發(fā)病過程中起重要作用。
　　 第二部分：高氧暴露對人肺腺癌A549細(xì)胞中硫氧還蛋白-2及細(xì)胞色素C表達(dá)的影響
　　 目的：研究高濃度氧暴露對人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞來源的肺腺癌A549細(xì)胞中硫氧還蛋白-2

9、及細(xì)胞色素C表達(dá)的影響，探討Trx-2和Cytc的表達(dá)變化在高氧肺損傷發(fā)生發(fā)展中所起的作用，Trx-2對高氧肺損傷線粒體的保護(hù)作用。
　　 方法：體外傳代培養(yǎng) A549細(xì)胞系，待其在37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中生長至接近亞匯合狀態(tài)時(shí)，隨機(jī)分為高氧組和空氣組。高氧組持續(xù)暴露于常壓高濃度氧中，氧濃度＞90%，CO2濃度為5%；空氣組仍置于含5% CO2培養(yǎng)箱中。兩組分別于高氧或空氣暴露12、24、48 h 提取A549細(xì)胞總RNA和

10、蛋白,采取半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）測定Trx-2、Cytc mRNA的表達(dá)；采用 Western blot檢測A549細(xì)胞Trx-2 蛋白的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：(1)與空氣組相比，高氧暴露12 h A549細(xì)胞Trx-2 mRNA表達(dá)減弱，但兩者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。24 h Trx-2 mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)；48 h后Trx-2 呈下降趨勢，其表達(dá)較空氣組減弱，但兩者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (

11、2)與空氣組相比，高氧暴露12h Cytc mRNA的表達(dá)顯著增強(qiáng)，24h Cytc mRNA的表達(dá)減弱，但兩者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，48h顯著減弱。
　　 (3)與空氣組相比，高氧暴露12h Trx-2 蛋白的表達(dá)顯著增強(qiáng)，24h Trx-2 蛋白的表達(dá)仍增強(qiáng)，但兩者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨后逐漸減弱，至48h顯著減弱。
　　 結(jié)論：高濃度氧暴露誘導(dǎo)A549細(xì)胞中Trx-2和 Cytc 異常表達(dá)，提示Cytc 在高氧肺

12、損傷細(xì)胞凋亡發(fā)生過程中可能起重要作用，Trx-2對高氧肺損傷線粒體可能起重要的保護(hù)作用。
　　 第三部分：小分子干擾RNA抑制高氧暴露下A549細(xì)胞中Trx-2表達(dá)及其與肺細(xì)胞代謝和凋亡的關(guān)系
　　 目的：研究小分子干擾RNA抑制高氧暴露下人肺腺癌A549細(xì)胞中硫氧還蛋白-2表達(dá)及其與肺細(xì)胞代謝和凋亡的關(guān)系，探討高氧肺損傷的發(fā)病機(jī)制和防治措施。
　　 方法：體外傳代培養(yǎng)A549細(xì)胞系，待其在37℃ 5% CO2培

13、養(yǎng)箱中生長至接近亞匯合狀態(tài)時(shí)，將體外化學(xué)合成Trx-2 序列特異性的SiRNA通過Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞。隨機(jī)分為Ⅰ空氣組，Ⅱ高氧組，Ⅲ小分子干擾RNA空氣組，Ⅳ小分子干擾RNA高氧組。高氧組持續(xù)暴露于常壓高濃度氧中，氧濃度為95%，CO2濃度為5%；空氣組仍置于含5% CO2培養(yǎng)箱中。四組分別于高氧或空氣暴露12、24、48h提取A549細(xì)胞總RNA和蛋白。采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)測定Trx-2、三磷

14、酸腺苷合成酶6，8及細(xì)胞色素CmRNA的表達(dá),采用Western blot方法檢測Trx-2蛋白的表達(dá),流式細(xì)胞術(shù)檢測高氧暴露和沉默Trx-2基因?qū)549細(xì)胞凋亡的影響。
　　 結(jié)果：(1)序列特異性SiRNA可顯著抑制Trx-2表達(dá)，Western blot檢測顯示Trx-2蛋白表達(dá)明顯下降，SiRNA-1、SiRNA-2、SiRNA-3三組中Trx-2蛋白表達(dá)均受到抑制，SiRNA-1組抑制效率最高（79.51%）。

15、>　　 (2)與空氣組相比，高氧組24h Trx-2和Cytc mRNA的表達(dá)顯著增高，但在48h Cytc mRNA的表達(dá)顯著降低。與小分子干擾RNA空氣組相比，小分子干擾RNA高氧組24、48h Trx-2mRNA的表達(dá)顯著減弱但在12、24h Cytc mRNA表達(dá)水平顯著升高。與高氧組相比，小分子干擾RNA高氧組48h Trx-2 mRNA的表達(dá)顯著減弱，而24h Cytc mRNA表達(dá)顯著升高。
　　 (3)與空氣組

16、相比，高氧組12、48h ATPase6 mRNA的表達(dá)顯著增高，但在24、48h ATPase8 mRNA的表達(dá)顯著增高。與小分子干擾RNA空氣組相比，小分子干擾RNA高氧組24、48h ATPase6，8 mRNA的表達(dá)顯著減弱。與高氧組相比，小分子干擾RNA高氧組12、48h ATPase6 mRNA的表達(dá)顯著減弱，而12、48h ATPase8 mRNA表達(dá)顯著升高。
　　 (4)與高氧組相比，小分子干擾RNA高氧組24

17、h A549細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)明顯增高，分別為（31.78±4.52）%VS（13.57±0.69）%；小分子干擾RNA高氧組24、48h A549細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)明顯高于小分子干擾RNA空氣組，分別為（31.78±4.52）%VS（15.47±0.57）%，（38.51±4.08）%VS（25.84±1.01）%。
　　 結(jié)論：高氧暴露和沉默Trx-2基因?qū)е翧549細(xì)胞ATPase6，8表達(dá)異常和Cytc表達(dá)升高，細(xì)胞凋亡百分率顯