MAPK信號對高氧肺損傷Aquaporin5的調(diào)控機制.pdf

1、第一部分 MAPK通路對H<,2>O<,2>刺激狀態(tài)下MLE-12細胞AQP5表達的調(diào)控 背景:MLE-12 是小鼠來源的肺上皮細胞株，在研究肺泡上皮細胞膜蛋白表達及調(diào)節(jié)方面具有良好的特異性。已有研究證實，暴露于95％氧氣以及H<,2>O<,2>應(yīng)激可觸發(fā)轉(zhuǎn)錄因子AP-1及MAPK家族p38、JNK 成員的持續(xù)激活，從而介導(dǎo)高氧所致腫脹性細胞死亡以及細胞凋亡，且細胞的存活率在特異性抑制劑抑制MAPK活化的同時得到明顯的改善。AQ

2、P5在維持肺液體平衡以及肺水腫形成中具有關(guān)鍵性作用，已有脂多糖及腫瘤壞死因子-α對MLE-12細胞AQP5蛋白及mRNA表達影響的報道，但對于高氧誘導(dǎo)下細胞．AQP5表達的相關(guān)研究還知之甚少。本研究擬復(fù)制氧化攻擊細胞模型，研究離體氧化模型AQP5表達的變化，并通過MAPK信號途徑抑制劑阻斷其蛋白激酶的活化，觀察其對高氧應(yīng)激下MLE-12細胞AQP5表達的影響，為急性肺損傷修復(fù)探索新的方法。 目的: 1．建立氧化性細胞模型

3、。 2．觀察不同濃度、不同時間H<,2>O<,2>刺激對MLE-12細胞MAPK (ERK、 JNK、p38)的影響。 3．觀察不同濃度、不同時間H<,2>O<,2>刺激對細胞AQP5表達的影響。 4．使用MAPK信號抑制劑，研究其對MLE-12細胞AQP5表達的影響，探討MAPK途徑是否參與了MLE-12細胞AQP5的表達。 方法: 1．貼壁培養(yǎng) MLE-12，H<,2>O<,2>作為外源性RO

4、S，選用不同作用濃度(125μM、250μM、500μM、1000μM)H<,2>O<,2>刺激 1 小時及250μMH<,2>O<,2>作用不同時間，復(fù)制氧化性細胞損傷模型。 2．Western blot法檢測氧化損傷細胞磷酸化MAPK (ERK、p38、JNK)蛋白表達并采用相關(guān)抑制劑阻斷MAPK蛋白表達。 3．分別用Western blot法和FQ-PCR法檢測氧化損傷細胞AQP5蛋白及mRNA基因表達，并選用MA

5、PK信號通路抑制劑作用細胞，研究阻斷MAPK信號途徑表達后AQP5基因表達的影響。 結(jié)果: 1．MLE-12細胞磷酸化MAPK蛋白表達隨H<,2>O<,2>刺激濃度升高而逐漸增加，與對照組比較，ERK、p38及JNK三亞族在125μM H<,2>O<,2> 刺激下蛋白表達即明顯增加(P<0.05)，1000μM時最強，呈濃度依賴性。 2．MLE-12細胞隨H<,2>O<,2>作用時間延長，磷酸化MAPK蛋白表達呈

6、上升趨勢，ERK、p38表達均在H<,2>O<,2>作用1h最強，但ERK在作用3h 后即降至正常，p38在H<,2>O<,2> 5h 后仍高于正常對照組；JNK 蛋白表達在H<,2>O<,2>作用 3h 最強，第5h與正常對照組比較無明顯差異。 3．選用ERK抑制劑PD98059 20μM、p38抑制劑SB203580 20μM、JNK抑制劑SP600125 25gM 均能抑制磷酸化ERK、p38、JNK蛋白表達。 4

7、．Western blot結(jié)果顯示：對照組AQP5蛋白呈陽性表達，在250μMH<,2>O<,2>刺激時即表達降低，后隨濃度增加呈逐漸降低趨勢；在250μMH<,2>O<,2>氧化刺激不同時間時，AQP5蛋白表達總體呈降低趨勢。不同MAPK抑制劑干預(yù)組僅見SB203580組AQP5蛋白表達較相應(yīng)H<,2>O<,2>刺激組增高。 5．FQ-PCR結(jié)果顯示：隨H<,2>O<,2>刺激濃度增高，AQP5 mRNA表達呈逐漸降低趨勢，以

8、500μM H<,2>O<,2>刺激時表達最低；在250μM H<,2>O<,2>作用不同時間，AQP5mRNA水平隨氧化攻擊時間的延長總體呈降低趨勢。MAPK抑制劑干預(yù)組僅見SB203580組對AQP5mRNA表達有影響。 結(jié)論: 采用不同濃度及不同作用時間H<,2>O<,2>攻擊MLE-12作為研究高氧應(yīng)激的體外細胞模型，H<,2>O<,2>能觸發(fā)MAPK信號家族ERK、p38、JNK的激活，信號通路抑制劑可有效抑制

9、三亞族的蛋白表達；H<,2>O<,2>使MLE-12細胞AQP5 mRNA及蛋白表達呈降低趨勢，抑制MAPK信號途徑中p38 的表達可阻斷氧化應(yīng)激狀態(tài)下AQP5基因表達的降低。 第二部分 MAPK通路對高氧肺損傷動物肺組織AOP5表達的調(diào)控 背景:急性肺損傷及急性呼吸窘迫綜合征起病急驟，發(fā)病持續(xù)，是多種高危因素引起的臨床危重疾病。近年來炎癥反應(yīng)在ALI及ARDS發(fā)病中的地位受到越來越多的關(guān)注。氧自由基是重要的炎癥介質(zhì)，多

10、形核白細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜酸粒細胞均能產(chǎn)生氧自由基，并參與肺損傷。隨著活性氧概念的擴展和延伸，氧氣在廣義上也屬于活性氧的范疇。吸入高濃度氧導(dǎo)致急性肺損傷在臨床中屢有發(fā)生，盡管大量的動物實驗研究顯示在肺損傷和肺水腫形成中AQP5發(fā)揮著重要作用，但對于高氧性肺損傷中AQP5的研究資料有限，對MAPK信號通路與高氧肺損傷二者相關(guān)性的動物實驗研究少有報道。本試驗擬建立高氧誘導(dǎo)ALI模型，探討AQP5在高氧誘導(dǎo)ALI的表達變化，并通過阻斷

11、MAPK信號通路，研究其對AQP5基因表達的影響，探明MAPK信號通路參與高氧誘導(dǎo)ALI調(diào)節(jié)AQP5的可能性，為有效控制AQP5在肺損傷的表達失衡提供實驗基礎(chǔ)。 目的: 1．建立幼鼠高氧誘導(dǎo)ALI模型。 2．觀察高氧暴露對肺組織MAPK (ERK、p38、JNK)的影響并摸索在體動物有效抑制MAPK蛋白表達的抑制劑濃度。 3．觀察高氧暴露對肺組織AQP5基因表達的影響，并應(yīng)用MAPK通路抑制劑，干預(yù)前后進

12、行對比分析，探討AQP5的分子調(diào)控機制。 方法: 1．實驗動物分組：幼年3周齡Wistar大鼠，隨機分為如下各組(n=6)：A組，空氣對照組；O<,3>組，高氧暴露3天組；O<,7>組，高氧暴露7天組；O<,14>組，高氧暴露14天組；O<,7>+PD組，靜脈注射ERK抑制劑PD98059后行高氧暴露7天；O<,7>+SB組，靜脈注射p38抑制劑SB203580后行高氧暴露7天；O<,7>+SP組，腹腔注射 JNK 抑制

13、劑SP600125后行高氧暴露7天；且同時設(shè)立抑制劑對照組(A+PD組、A+SB組、A+SP組)。 2．Western blot檢測肺組織磷酸化MAPK(ERK、p38、JNK)蛋白表達，并探討在體實驗中抑制劑阻斷MAPK蛋白表達的有效濃度；免疫組化分析MAPK蛋白在肺組織的分布。 3．分別用Western blot法和IHC法檢測高氧肺損傷肺組織AQP5蛋白表達，F(xiàn)Q-PCR法分析AQP5 mRNA基因表達。并選用MA

14、PK抑制劑阻斷MAPK蛋白表達，研究其對AQP5基因表達的影響。 結(jié)果: 1．高氧誘導(dǎo) ALI 的建立：實驗動物置于高氧艙中，連續(xù)行氧濃度監(jiān)測，保證氧濃度≥95％，高氧暴露組動物肺組織出現(xiàn)炎性細胞浸潤、水腫、出血、肺泡結(jié)構(gòu)破壞等肺損傷病理改變。 2．與空氣對照組比較，各高氧暴露組 ERK、p38、JNK 蛋白表達明顯增強，phospho-ERK、phospho-JNK在O<,7>組表達升高最為明顯(P<0.05)

15、，phospho-p38在O<,14>組表達最強(P<0.05)；抑制劑PD98059在靜脈注射0.3mg/kg時即表現(xiàn)出對ERK蛋白表達的抑制作用，而靜脈注射 SB203580 0.2mg/kg、腹腔注射SP600125 15mg/kg可有效抑制p38、JNK的蛋白表達，且抑制效應(yīng)隨抑制劑濃度的遞增呈增強趨勢。 3．空氣對照組僅肺泡上皮細胞及氣道上皮細胞少量磷酸化MAPK陽性表達，高氧肺損傷各組陽性細胞數(shù)明顯增多，廣泛分布在肺

16、內(nèi)不同細胞類型中，其中p38陽性表達尤多見于浸潤炎性細胞。 4．AQP5 主要表達于肺泡Ⅰ型上皮細胞及氣道分泌上皮頂質(zhì)膜，與空氣對照組比較，高氧損傷各組陽性細胞表達明顯減少；Western blot分析見 AQP5 蛋白表達隨高氧暴露時間的延長呈降低趨勢，尤以O(shè)<,7>組最為明顯；AQP5mRNA也隨高氧暴露時間增加而逐漸下調(diào)。 5．MAPK抑制劑干預(yù)后，O<,7>+SB203580、O<,7>+SP600125組肺組織

17、病理形態(tài)有明顯改善，且其AQP5蛋白及mRNA表達較高氧損傷組增加；而PD98059抑制劑組未見干預(yù)前后高氧肺損傷肺組織AQP5基因表達的變化。 結(jié)論: 成功復(fù)制幼年 Wistar 大鼠高氧誘導(dǎo) ALI 模型，高氧暴露可激活MAPK 信號通路ERK/p38/JNK，選用抑制劑適當(dāng)濃度即可有效阻斷MAPK 的蛋白活性；高氧肺損傷時AQP5蛋白及mRNA表達降低，三種抑制劑(PD98059/SB203580/SP600125