高氧致肺損傷新生鼠Occludin表達(dá)及其對肺上皮通透性影響.pdf

1、目的
　　 早產(chǎn)兒支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmon dysplasia,BPD)由Northway等在1967年首次提出,其發(fā)生與吸入高濃度氧、機(jī)械通氣治療、感染、動(dòng)脈導(dǎo)管未閉、營養(yǎng)、遺傳等因素有關(guān)。隨著圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)的迅速發(fā)展及肺表面活性物質(zhì)的普遍應(yīng)用,使得極低或超低出生體重兒存活率不斷提高,也使BPD的發(fā)病率有不斷增加的趨勢。大量研究表明,在導(dǎo)致早產(chǎn)兒BPD的眾多因素中,長期吸入高濃度氧氣是最主要原因和最危險(xiǎn)因素。臨床

2、上患有BPD的患兒通常因肺功能障礙需長時(shí)間依賴氧氣或反復(fù)的機(jī)械通氣治療,重者多于生后1年內(nèi)由于進(jìn)行性呼吸衰竭,肺動(dòng)脈高壓而死亡,嚴(yán)重影響了早產(chǎn)兒的生活和生存質(zhì)量。但由于目前BPD尚無理想的預(yù)防及治療手段,因此探討高氧致早產(chǎn)兒BPD的發(fā)病機(jī)制已成為國內(nèi)外新生兒領(lǐng)域的熱點(diǎn)研究。
　　 盡管高氧致BPD的發(fā)生機(jī)制尚未清楚,但其病理變化已明確,即早期的肺水腫、肺組織炎癥反應(yīng)及晚期的肺泡發(fā)育障礙、肺間質(zhì)纖維化。目前有關(guān)其發(fā)生機(jī)制的研究主要

3、集中在晚期肺纖維化階段,但肺纖維化一旦形成將是不可逆轉(zhuǎn)的。因此探討高氧致BPD早期的發(fā)病機(jī)制,對該病的預(yù)防及治療尤為重要。目前高氧致BPD早期發(fā)病機(jī)制主要涉及如下方面:(1)由于早產(chǎn)兒肺組織抗氧化酶系統(tǒng)的功能不足,吸入高氧后,產(chǎn)生過多的氧自由基。大量氧自由基不僅能夠引起肺泡上皮細(xì)胞和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、凋亡、壞死,同時(shí)引起肺泡毛細(xì)血管膜通透性增加,進(jìn)而導(dǎo)致炎性損傷及肺水腫的形成。(2)細(xì)胞因子的作用。越來越多的研究表明高氧致BPD早期,

4、細(xì)胞因子起著極為重要的作用。高氧可引起肺細(xì)胞持續(xù)產(chǎn)生多種細(xì)胞因子,例如:腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白介素(interleukin,IL)-1、IL-6、IL-8等,它們通過級聯(lián)放大效應(yīng)介導(dǎo)高氧狀態(tài)下的肺部炎癥反應(yīng),進(jìn)而導(dǎo)致肺組織的炎性損傷。然而以往的研究多著重于肺組織炎癥和氧化應(yīng)激損傷機(jī)制,有關(guān)肺水腫的發(fā)生機(jī)制研究較少,并且應(yīng)用炎癥因子的拮抗劑或抗氧化劑等干預(yù)后,高氧致肺損傷的程度并沒有減輕

5、,因此本實(shí)驗(yàn)嘗試以高氧肺損傷早期肺水腫的形成機(jī)制為切入點(diǎn),試圖為早產(chǎn)兒高氧肺損傷的防治奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和提供理論依據(jù)。
　　 近年來研究發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的急性肺損傷模型伴有肺上皮屏障功能的紊亂。肺泡上皮細(xì)胞間的緊密連接(tightjunction,TJ)是維持肺上皮屏障完整性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),它不僅能夠控制肺上皮細(xì)胞旁鈉水轉(zhuǎn)運(yùn),同時(shí)也能調(diào)節(jié)肺上皮通透性以及維持肺上皮細(xì)胞的極性。Occludin蛋白是TJ相關(guān)蛋白中的特征性蛋白。大量研究表明,

6、Occludin能夠參與調(diào)節(jié)細(xì)胞旁滲透性,其表達(dá)缺失導(dǎo)致上皮屏障通透功能紊亂(腦,腸,睪丸),與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。但高氧致肺損傷早期肺水腫的形成是否與Occludin表達(dá)異常導(dǎo)致肺上皮屏障功能的紊亂有關(guān),目前尚未見報(bào)道。
　　 本實(shí)驗(yàn)以高氧致肺損傷新生鼠模型為對象,研究其肺水腫發(fā)生階段Occludin基因及蛋白的表達(dá)變化,以及其對肺上皮屏障通透性的影響,旨在闡明緊密連接相關(guān)蛋白Occludin在高氧肺損傷早期肺水腫形

7、成中的作用。
　　 材料與方法
　　 一、動(dòng)物模型及分組
　　 (一)研究對象及分組
　　 健康成年Wistar大鼠(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動(dòng)物部提供),雌鼠20只,雄鼠5只,雌雄交配(4:1),雌鼠孕21-23d自然分娩的新生鼠320只(雌雄不限),生后12小時(shí)內(nèi)(0d)依據(jù)吸氧濃度.FiO2不同隨機(jī)分為高氧組和空氣組。
　　 (二)動(dòng)物模型的制備
　　 將新生Wister大鼠320只

8、依據(jù)吸入氧濃度隨機(jī)分為高氧組和空氣組,每組160只,雌雄不限。高氧組生后即置于氧箱中,持續(xù)輸入氧氣,FiO2≥0.95用測氧儀檢測),CO2濃度＜0.5%(用鈉石灰吸收,Dapex氣體分析儀檢測),溫度為25～27℃,濕度60%～70%(用變色硅膠吸收水蒸汽)。每天定時(shí)開箱15min,添加水、飼料及更換墊料,每24h與空氣組交換母鼠,以避免因氧中毒而致喂養(yǎng)能力下降?？諝饨M置于空氣環(huán)境下FiO2=0.21,具體方法及控制因素同高氧組。

9、r>　　 二、標(biāo)本的采集及處理
　　 每組分別于實(shí)驗(yàn)后的1,3,5,7d隨機(jī)抽取40只,用5%哥拉腹腔注射麻醉后立即打開胸腹腔。將其中10只剪斷腎動(dòng)脈放血活殺后,分離肺組織,左肺至于4%多聚甲醛中固定,用于觀察肺組織形態(tài)學(xué)改變,右肺上葉稱重后,制備成10%勻漿,測勻漿液血紅蛋白量,用于計(jì)算肺血管外肺水量(extravascular lung water,EVLW),右肺中、下葉于-80℃冰箱凍存,用于Occludin基因及蛋白

10、檢測;其中10只同樣放血活殺,左肺組織分離后立刻制備成5μm冰凍切片于-80℃冰箱凍存,用于免疫熒光檢測,右肺處理方法同上;其中10只直接分離肺組織,用于濕重/干重比率(wet/dry weight ration,W/D)測定;另外10只大隱靜脈注入FD4后氣管插管,向肺內(nèi)緩慢注入冷生理鹽水0.5mL,然后回抽,反復(fù)操作3次,80%～90%回收,收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)<

11、br>　　 三、實(shí)驗(yàn)方法及檢測指標(biāo)
　　 1、蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色法觀察肺組織病理變化
　　 2、HE染色后,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每張切片按照Gustavo等方法:顯微鏡下(400×)選取5個(gè)視野,按照(見表1)方式對肺損傷程度進(jìn)行雙盲評定。
　　 3、稱量法測定肺組織W/D
　　 4、采用Noble氏法加以改進(jìn),測定肺組織EVLW。具體公式如下:
　　 每克濕肺含

12、殘血量=(勻漿液Hb/血漿Hb)×勻漿總樣本量×1.055/勻漿肺重量濕肺含殘血量=肺濕重×每克濕肺含殘血量EVLW(ml/g)=(肺濕重.肺干重.濕肺含殘血量)/肺干重
　　 5、采用FD4示蹤劑法測定肺上皮通透性
　　 以BALF/血清FD4比值作為衡量支氣管肺泡上皮通透性的指標(biāo)。
　　 6、免疫熒光染色法觀察肺組織Occludin蛋白分布
　　 7、RT-PCR檢測肺組織中Occludin mRNA

13、表達(dá)
　　 8、Western Blot技術(shù)檢測肺組織中Occludin蛋白水平
　　 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,所有數(shù)據(jù)均以(x)±s表示,采用t檢驗(yàn)比較兩組同一時(shí)間點(diǎn)的結(jié)果是否具有差異,多組間比較采用ANOVA分析,應(yīng)用SAS9.2軟件進(jìn)行Spearnlan相關(guān)性分析,P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)果
　　 一、肺組織形態(tài)學(xué)觀察
　　 1～7d

14、空氣組肺泡間隔逐漸變薄,肺泡結(jié)構(gòu)逐漸規(guī)整;與空氣組比較,高氧1d無明顯變化;高氧3d可見肺泡間隔內(nèi)有少量出血、水腫及中性粒細(xì)胞的浸潤,肺泡間隔增厚;高氧5d肺泡間隔繼續(xù)增厚,間質(zhì)水腫進(jìn)行性加重,中性粒細(xì)胞和紅細(xì)胞浸潤到肺泡腔內(nèi),可見部分肺泡壁斷裂;高氧7d肺泡間隔顯著增厚,紅細(xì)胞碎片和蛋白水腫液充填于肺泡腔內(nèi)。
　　 二、急性肺損傷病理評分
　　 與空氣組比較,高氧1d肺損傷病理評分無明顯變化(P＞0.05),高氧3d開

15、始增加(P＜0.01),高氧7d肺損傷評分達(dá)峰值(P＜0.01)。
　　 三、肺組織含水量的變化
　　 與空氣組比較,高氧1dW/D無明顯變化(P＞0.05),高氧3d起W/D增加(P＜0.05),高氧5d、7d進(jìn)行性增加(P＜0.01);與空氣組比較,高氧1dEVLW無明顯變化(P＞0.05),高氧3d,5d,7dEVLW進(jìn)行性增加(P＜0.01)。
　　 四、肺上皮通透性的變化
　　 與空氣組比較,高

16、氧1dBALF/血清FD4比值無明顯變化(P＞0.05),高氧3d起B(yǎng)ALF/血清FD4比值開始增加(P＜0.05),高氧5d、7d進(jìn)行性增加(P＜0.01)。
　　 五、肺組織Occludin的表達(dá)
　　 (一)肺組織Occludin的分布及表達(dá)
　　 空氣組肺組織中,在肺泡上皮細(xì)胞邊緣Occludin蛋白呈現(xiàn)線性連續(xù)分布,并且綠色熒光強(qiáng)度較強(qiáng),與空氣組比較,其在高氧組表達(dá)稀疏、斷裂,熒光強(qiáng)度較弱。
　　

17、 (二)肺組織Occludin mRNA表達(dá)。
　　 與空氣組比較,高氧1dOccludin mRNA表達(dá)無明顯變化(P＞0.05),高氧3d和5dOccludin mRNA表達(dá)進(jìn)行性減少(P＜0.05),高氧7d減少最明顯(P＜0.01)。
　　 (三)肺組織Occludin蛋白表達(dá)
　　 與空氣組比較,高氧1d,3dOccludin蛋白表達(dá)無明顯變化(P＞0.05),高氧5d有所減少(P＜0.05),高氧7

18、d減少最明顯(P＜0.01)。
　　 六、相關(guān)性分析
　　 高氧致肺損傷新生鼠肺組織Occludin mRNA表達(dá)與肺上皮通透性呈現(xiàn)明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.706,P＜0.01);Occludin蛋白表達(dá)與肺上皮通透性呈現(xiàn)明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.755,P＜0.01)。
　　 結(jié)論
　　 新生鼠高氧暴露早期肺水腫形成階段,肺上皮通透性逐漸增加,肺上皮緊密連接相關(guān)蛋白Occludin表達(dá)稀疏、斷裂,并且不論是其