基于胸腺代謝組學(xué)和生物種基因的衛(wèi)氣年節(jié)律及衛(wèi)氣虛證的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、衛(wèi)氣學(xué)說(shuō)源于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，是中醫(yī)學(xué)基本理論之一。代謝組學(xué)技術(shù)提供了這個(gè)方面的可能性。代謝組學(xué)(metabolomics/metabonomics)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后興起的系統(tǒng)生物學(xué)的一個(gè)新的分支，是系統(tǒng)研究病理生理刺激后代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律，來(lái)揭示機(jī)體生命活動(dòng)代謝本質(zhì)的科學(xué)，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分。它以組群指標(biāo)分析為基礎(chǔ)，以高通量檢測(cè)和數(shù)據(jù)處理為手段，定性定量研究生物體的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，分析生物體在不同狀態(tài)下代謝指

2、紋圖譜的差異，獲得相應(yīng)的生物標(biāo)志物群，從而揭示生物體在特定時(shí)間、環(huán)境下的整體功能狀態(tài)。代謝組學(xué)拋開(kāi)體內(nèi)紛繁復(fù)雜的生化分子互相作用和網(wǎng)絡(luò)式代謝過(guò)程變化，對(duì)代謝的終端產(chǎn)物進(jìn)行多元化綜合分析，從整體上展示生物體內(nèi)在的變化狀態(tài)，避免了以往采用單一指標(biāo)或少數(shù)幾個(gè)指標(biāo)研究某種病理和生理變化的片面性，與中醫(yī)治療疾病和用藥的整體觀念相吻合。
　　我們前期的研究已經(jīng)初步證實(shí)衛(wèi)氣的年節(jié)律變化的存在，而節(jié)律變化的內(nèi)在原因尚不清楚，生物鐘基因的研究深入提

3、供了探討該問(wèn)題的可能。生物鐘基因普遍存在于生物界，其作用在于產(chǎn)生和控制晝夜生物節(jié)律的運(yùn)轉(zhuǎn)。晝夜節(jié)律變化普遍存在于各種生物體，生物的多種生理、生化、行為過(guò)程中都表現(xiàn)出一定的晝夜節(jié)律特征。生物鐘基因的發(fā)現(xiàn)和對(duì)其活動(dòng)規(guī)律的揭示，使對(duì)生物晝夜節(jié)律的研究獲得突破性進(jìn)展。而生物鐘相關(guān)的衛(wèi)氣年節(jié)律研究目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)運(yùn)用現(xiàn)代時(shí)間生物學(xué)理論及其研究方法探索衛(wèi)氣的年節(jié)律性變化特征，為衛(wèi)氣相關(guān)疾病的臨床治療提供理論參考和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在哺乳動(dòng)物中，生物

4、節(jié)律主要包括Clock、Bmall、Per、Cry等在內(nèi)的生物鐘基因及其蛋白產(chǎn)物組成的自身調(diào)控反饋環(huán)路。
　　本課題遵循整體觀念和《內(nèi)經(jīng)》衛(wèi)氣理論的本意，依據(jù)衛(wèi)氣年節(jié)律的周期變化，在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，依據(jù)自然界的年周期規(guī)律，在農(nóng)歷的春分、夏至、秋分和冬至四個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)大鼠胸腺進(jìn)行代謝組學(xué)檢測(cè)，并對(duì)血淋巴細(xì)胞進(jìn)行生物鐘相關(guān)基因表達(dá)測(cè)定，從而探討衛(wèi)氣年節(jié)律變化的基因節(jié)律調(diào)節(jié)機(jī)制，尋找體現(xiàn)衛(wèi)氣年周期變化的小分子物質(zhì)基礎(chǔ)，推測(cè)在自然界年周期

5、變化的時(shí)相下，生物鐘相關(guān)基因與發(fā)揮防御機(jī)制的衛(wèi)氣小分子物質(zhì)的聯(lián)動(dòng)調(diào)節(jié)機(jī)制。通過(guò)研究衛(wèi)氣的年周期變化及調(diào)節(jié)機(jī)制、探尋衛(wèi)氣的實(shí)質(zhì)及物質(zhì)基礎(chǔ)，為中醫(yī)臨床衛(wèi)氣相關(guān)疾病的預(yù)防和診治提供實(shí)驗(yàn)學(xué)支持。本文主要從以下幾部分展開(kāi)論述:
　　第一部分 衛(wèi)氣節(jié)律的相關(guān)理論探討
　　目的:從相關(guān)文獻(xiàn)中發(fā)掘衛(wèi)氣的節(jié)律性變化規(guī)律及相關(guān)物質(zhì)基礎(chǔ)
　　方法:查閱和提煉文獻(xiàn)，從衛(wèi)氣的生成來(lái)源、循行、功能、本質(zhì)、有關(guān)節(jié)律、衛(wèi)氣理論的臨床應(yīng)用等角度，對(duì)衛(wèi)氣

6、進(jìn)行綜合論述，為衛(wèi)氣的節(jié)律性研究提供理論支持。
　　結(jié)論:目前衛(wèi)氣的現(xiàn)代研究大多忽略了衛(wèi)氣的年、月、日的生理節(jié)律及慓疾滑利的運(yùn)行特點(diǎn)，對(duì)衛(wèi)氣的物質(zhì)本質(zhì)及節(jié)律的形成機(jī)制還缺乏整體而全面的認(rèn)識(shí)和研究。
　　第二部分 實(shí)驗(yàn)研究
　　實(shí)驗(yàn)一:基于胸腺代謝組學(xué)對(duì)正常SD雄性大鼠衛(wèi)氣年節(jié)律變化的研究
　　目的:通過(guò)代謝組學(xué)的方法對(duì)春夏秋冬四季的SD大鼠的胸腺進(jìn)行物質(zhì)測(cè)定，找出四季都包括并且存在變化節(jié)律的物質(zhì)。
　　方法

7、:SD雄性大鼠衛(wèi)氣虛模型組采用疲勞寒熱交替刺激法制備，正常組給予常規(guī)飼養(yǎng)，每日灌服等量等溫純凈水。分別于秋分日（2013年9月23日）、冬至日（2013年12月22日）、春分日（2014年3月21日）、夏至日（2014年6月21日的中午12:00左右，對(duì)秋分、冬至、春分、夏至四組大鼠（每組20只）斷頭取血，用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，對(duì)胸腺進(jìn)行代謝物檢測(cè)。利用主成分分析法(principal componentanalysis，PCA)和偏

8、最小二乘法(partial least squares，PLS)對(duì)檢測(cè)的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果:春、夏、秋、冬四個(gè)季節(jié)中正常組與模型組具有明顯差異的代謝譜變化，本研究在負(fù)離子模式下共獲得5個(gè)主成分，累積R2X=0.803，如Table1.1所示。我們推測(cè)出cAMP（環(huán)磷酸腺苷）、Malic acid(蘋(píng)果酸)、Homocarnosine(高肌肽)、Uridine(尿苷)、Cortisol(皮質(zhì)醇)為體現(xiàn)衛(wèi)氣在不同季節(jié)變化規(guī)律

9、的潛在標(biāo)志物。
　　結(jié)論:推測(cè)出cAMP（環(huán)磷酸腺苷）、Malic acid(蘋(píng)果酸)、Homocamosine(高肌肽)、Uridine(尿苷)、Cortisol(皮質(zhì)醇)可能為代表衛(wèi)氣在不同季節(jié)變化的潛在標(biāo)志物。
　　實(shí)驗(yàn)二:基于胸腺代謝組學(xué)對(duì)衛(wèi)氣虛SD大鼠代謝物變化及玉屏風(fēng)干預(yù)效果的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:運(yùn)用代謝組學(xué)方法研究衛(wèi)氣虛SD大鼠經(jīng)玉屏風(fēng)顆粒干預(yù)的胸腺代謝組學(xué)特征，對(duì)發(fā)現(xiàn)的潛在衛(wèi)氣虛標(biāo)記物進(jìn)行反證，以明確其

10、可靠性。
　　方法:SD雄性大鼠衛(wèi)氣虛模型組采用疲勞寒熱交替刺激法制備，治療組給予玉屏分散顆粒溶液灌服，正常組給予常規(guī)飼養(yǎng)，每日灌服等量等溫純凈水。分別于秋分日（2013年9月23日）、冬至日（2013年12月22日）、春分日(2014年3月21日)、夏至日（2014年6月21日）的中午12:00左右，對(duì)正常組、模型組和治療組3組大鼠（每組40只）斷頭取血，用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，對(duì)胸腺進(jìn)行代謝物檢測(cè)。利用主成分分析法(princ

11、ipal component analysis，PCA)和偏最小二乘法(partialleast squares，PLS)對(duì)檢測(cè)的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并與正常組比較，反證玉屏散的治療效果。
　　結(jié)果:實(shí)驗(yàn)大鼠在處于衛(wèi)氣虛狀態(tài)時(shí)蘋(píng)果酸、環(huán)磷酸腺苷、高肌肽、皮質(zhì)醇四種物質(zhì)與正常組相比呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，尿苷與正常組相比呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，給予玉屏風(fēng)顆粒干預(yù)治療后衛(wèi)氣虛狀態(tài)被打破，病理變化出現(xiàn)扭轉(zhuǎn)，前兩種物質(zhì)又開(kāi)始向正常組水平靠攏，尿苷也開(kāi)始向正常組

12、水平偏離，因此該實(shí)驗(yàn)反證了蘋(píng)果酸、環(huán)磷酸腺苷和尿苷三種是衛(wèi)氣虛證的潛在標(biāo)志物的可能性，高肌肽和皮質(zhì)醇兩種物質(zhì)在給予玉屏風(fēng)顆粒干預(yù)治療后變化趨勢(shì)不明顯。
　　結(jié)論:玉屏風(fēng)顆粒干預(yù)后衛(wèi)氣虛證SD大鼠出現(xiàn)代謝譜的回歸;蘋(píng)果酸、環(huán)磷酸腺苷、尿苷在治療后回調(diào)，反證了這三種物質(zhì)作為衛(wèi)氣虛證潛在證候標(biāo)記物的可靠性;糾正紊亂的氨基酸代謝及磷脂類(lèi)代謝可能是玉屏風(fēng)顆粒在分子層面治療衛(wèi)氣虛證的作用機(jī)制之一。
　　實(shí)驗(yàn)三:生物種基因Clock、Bm

13、all和Cry1在衛(wèi)氣虛SD大鼠及玉屏風(fēng)干預(yù)效果的年節(jié)律變化的實(shí)驗(yàn)研究
　　方法:分別在春分、夏至、秋分、冬至前2周將30只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組和治療組，SD雄性大鼠衛(wèi)氣虛模型組采用疲勞寒熱交替刺激法制備，治療組給予玉屏分散顆粒溶液灌服，正常對(duì)照組給予常規(guī)飼養(yǎng)，每日灌服等量等溫純凈水。用RT-PCR法檢測(cè)各個(gè)季節(jié)大鼠血淋巴細(xì)胞鐘基因Clock、Bmall和Cry1表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.與同節(jié)氣正常對(duì)

14、照組比較，相應(yīng)模型組大鼠鐘基因Clock表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與春分比較，正常對(duì)照組、模型組夏至、秋分、冬至鐘基因Clock表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與夏至、秋分比較，正常對(duì)照組、模型組冬至鐘基因Clock表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而夏至、秋分鐘基因Clock表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與同節(jié)氣模型組比較，相應(yīng)治療組大鼠鐘基因Clock表達(dá)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

15、＜0.05)。
　　2.與同節(jié)氣正常對(duì)照組比較，相應(yīng)模型組大鼠鐘基因Bmall表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與春分比較，模型組夏至、秋分、冬至鐘基因Bmall表達(dá)降低，正常對(duì)照組秋分、冬至鐘基因Bmall表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而夏至表達(dá)降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與夏至、秋分比較，正常對(duì)照組、模型組冬至鐘基因Bmall表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而夏至、秋分鐘基因

16、Bmall表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與同節(jié)氣模型組比較，相應(yīng)治療組春分、冬至大鼠鐘基因Bmall表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而夏至、秋分鐘基因Bmall表達(dá)升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3.與同節(jié)氣正常對(duì)照組比較，相應(yīng)模型組大鼠鐘基因Cry1表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與春分比較，正常對(duì)照組、模型組夏至、秋分、冬至鐘基因Cry1表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05

17、)。與夏至、秋分比較，正常對(duì)照組、模型組冬至鐘基因Cry1表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而夏至、秋分鐘基因Cry1表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與同節(jié)氣模型組比較，相應(yīng)治療組大鼠鐘基因Cry1表達(dá)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.衛(wèi)氣虛模型大鼠與正常大鼠血淋巴細(xì)胞鐘基因Clock表達(dá)存在季節(jié)性節(jié)律變化，且兩者變化存在關(guān)聯(lián)性，玉屏風(fēng)干預(yù)后大鼠鐘基因Clock表達(dá)均升高，差異有

18、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.衛(wèi)氣虛模型大鼠與正常大鼠血淋巴細(xì)胞鐘基因Bmal1表達(dá)存在季節(jié)性節(jié)律變化，且兩者變化存在關(guān)聯(lián)性。玉屏風(fēng)干預(yù)后春分、冬至大鼠鐘基因Bmall表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而夏至、秋分鐘基因Bmall表達(dá)升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)
　　3.衛(wèi)氣虛模型大鼠與正常大鼠血淋巴細(xì)胞鐘基因Cry1表達(dá)存在季節(jié)性節(jié)律變化，且兩者變化存在關(guān)聯(lián)性。玉屏風(fēng)干預(yù)后與同節(jié)氣模型組比較，