基于代謝組學(xué)技術(shù)的糖尿病特征代謝物及維醫(yī)證型研究.pdf

1、目的：
　　本文采用1H-NMR、UPLC/TOF-MS作為代謝組學(xué)研究的檢測手段，以糖尿病患者和正常人的尿液為研究對象，分析了糖尿病患者尿液的特征代謝譜；進(jìn)一步采用HPLC和GC法的代謝靶標(biāo)技術(shù)定量測定尿液及血清中氨基酸、脂肪酸類代謝物。采用模式識別方法對與糖尿病相關(guān)的代謝物質(zhì)進(jìn)行全面的研究，從西醫(yī)診斷到維醫(yī)辨證分型等不同層面闡述與糖尿病代謝相關(guān)的差異物質(zhì)，為全面理解糖尿病在發(fā)病機(jī)制上的差異和聯(lián)系提供了一個新視角和實驗基礎(chǔ)。

2、r>　　方法：
　　1．利用基于NMR的代謝組學(xué)方法研究維吾爾族2型糖尿病尿液代謝特征，建立穩(wěn)定的NMR尿液一維氫譜，分析2型糖尿病人及正常人尿液特征代謝物。根據(jù)維醫(yī)分型將糖尿病患者分為不同體液證型，進(jìn)一步利用建立的方法尋找不同證型間的差異標(biāo)志物。
　　2．采用超高效液相色譜-四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜（UPLC Q-TOFMS）技術(shù)分析糖尿病及正常人尿液的代謝譜，結(jié)合多元數(shù)據(jù)分析尋找糖尿病和正常人的差異物質(zhì)。根據(jù)精確分子量、按

3、照差異代謝物的種類在譜庫中進(jìn)行檢索，對其進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定并與NMR結(jié)果進(jìn)行比較。
　　3．建立高效液相色譜（HPLC）分析生物樣品中游離氨基酸的代謝靶標(biāo)分析技術(shù)，以維吾爾族糖尿病及正常人血清/尿液為研究對象，測定氨基酸代謝譜，結(jié)合多元統(tǒng)計分析評估氨基酸代謝譜對糖尿病發(fā)病的影響。進(jìn)一步將該方法應(yīng)用于糖尿病小鼠模型中，充分研究糖尿病小鼠的氨基酸代謝變化。
　　4．建立氣相色譜（GC）技術(shù)檢測血清中游離脂肪酸的技術(shù)平臺，優(yōu)化了GC色

4、譜的最優(yōu)條件。用該法分析2型糖尿病患者和正常健康者血清的7種游離脂肪酸，結(jié)合多元統(tǒng)計分析尋找脂肪酸代謝譜的差異，對脂肪酸代謝異常進(jìn)行系統(tǒng)評價。
　　結(jié)果：
　　1．建立了1H-NMR的尿液代謝組學(xué)方法，糖尿病患者和正常人經(jīng)代謝組學(xué)方法得到很好的區(qū)分，并找到了相對應(yīng)的多個糖尿病標(biāo)志物。DM組的大部分代謝物濃度較正常人低。結(jié)合兩組樣品的NMR譜圖的不同輪廓，與正常人相比，DM患者尿液中的葡萄糖、馬尿酸、甜菜堿、?；撬岬壬撸涣涟?/p>

5、酸、異亮氨基酸、肌酸酐、檸檬酸、二甲胺等含量較正常人低。根據(jù)維吾爾醫(yī)分型將患者分為不同異常體液證型，進(jìn)一步利用NMR技術(shù)對不同證型糖尿病及健康人尿液進(jìn)行代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)三種異常體液糖尿病患者尿液差異物質(zhì)相似，異常粘液質(zhì)患者尿液中的代謝差異與其他兩類都有顯著差異，成為各個異常體液中代謝變化最為顯著的體液類型。
　　2．建立了UPLC-Q/TOF-MS的尿液代謝組學(xué)研究方法，糖尿病患者尿液中的糖、脂、氨基酸等代謝通路都發(fā)生了紊亂，在

6、糖類代謝物中，鈉葡萄糖醛酸含量明顯高于正常對照組，在脂肪酸類物質(zhì)中，與正常對照組相比，20-羧基花生四烯酸，棕櫚酸在糖尿病患者尿液中比在正常人中高。氨基酸類代謝物中，酪氨酸、N-β-丙氨酰-L組氨酸、色氨酸含量較正常人低，戊二酸、煙酰甘氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸等含量升高。這些代謝物均是與體內(nèi)糖、脂代謝相關(guān)的調(diào)節(jié)物質(zhì)，進(jìn)一步說明了糖尿病患者發(fā)生了相關(guān)代謝紊亂。1H-NMR技術(shù)所得到的標(biāo)記物和UPLC-Q/TOF得到的標(biāo)記物大部分不同，但是

7、分組聚類結(jié)果類似。
　　3．以反相色譜柱和梯度洗脫對生物樣品氨基酸進(jìn)行HPLC分離。通過色譜條件的優(yōu)化及對方法學(xué)考察，說明選擇的衍生化方法重復(fù)性好、穩(wěn)定性高。另外，通過正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）對HPLC得到的氨基酸數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。研究發(fā)現(xiàn)，HPLC分析得到的血清及尿液氨基酸代謝譜能明顯表征出糖尿病患者和正常人的代謝表型差異，有效的區(qū)分糖尿病患者和健康對照組的氨基酸代謝輪廓。在糖尿病血清氨基酸代謝靶標(biāo)分析中，糖尿病患者

8、血清氨基酸代謝譜中對分組貢獻(xiàn)最大的是天冬氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、絲氨酸，而在單維統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)天冬氨酸和苯丙氨酸代謝異常最為明顯，較正常人明顯升高，而較正常人顯著下降的氨基酸有丙氨酸、甘氨酸和賴氨酸。在尿液的代謝譜比較時發(fā)現(xiàn)多元分析中得到絲氨酸、蘇氨酸、?；撬釋M間貢獻(xiàn)較大，而單維統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)尿液中?；撬帷⒕彼?、絲氨酸和組氨酸較正常人顯著下降，谷氨酸顯著升高。兩種方法處理得到的結(jié)果可以互為補(bǔ)充。在糖尿病動物模型氨基酸譜的研究中發(fā)現(xiàn)所有氨基

9、酸在單維統(tǒng)計分析中均無差異，而在多元統(tǒng)計分析中，通過PLS-DA負(fù)載圖可見，精氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、牛磺酸對組間貢獻(xiàn)較大，這些氨基酸可能承載著小鼠成模后藥理過程中代謝途徑變化的重要信息。本研究說明HPLC靶標(biāo)分析技術(shù)可以作為高效和簡單的技術(shù)平臺用于糖尿病的代謝輪廓研究，是一種潛在的早期診斷手段。
　　4．建立了以硫酸/甲醇為甲酯化試劑測定血清中FFA的GC分析方法，同時優(yōu)化了GC色譜的最優(yōu)條件。利用多元統(tǒng)計分析結(jié)合模式識別方式，

10、結(jié)合 PCA和OPLS-DA對數(shù)據(jù)進(jìn)行模式識別對兩組人群進(jìn)行了有效區(qū)分，發(fā)現(xiàn)肉豆蔻酸在糖尿病患者血清中升高，而油酸在糖尿病患者中特異性下調(diào)，提示這兩種物質(zhì)可能分別為潛在特異性標(biāo)志物，為區(qū)分糖尿病和體內(nèi)脂肪酸失衡的關(guān)系提供了重要的實驗依據(jù)。
　　結(jié)論：
　　1H-NMR技術(shù)和UPLC-Q/TOF技術(shù)作為常用的代謝組學(xué)分析工具，在標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)中有一定的互補(bǔ)性。通過對正常人和糖尿病患者尿液的代謝譜研究，發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)具有很好的疾病診斷