基于胸腺代謝組學(xué)的衛(wèi)氣月節(jié)律研究及節(jié)律機制探討.pdf

1、衛(wèi)氣是行于脈外而具有保衛(wèi)作用的氣，是人體之氣的重要組成部分?！鹅`樞·本藏》云:“衛(wèi)氣者，所以溫分肉，充皮膚，肥腠理，司開闔者也。”即是對衛(wèi)氣防御外邪、溫養(yǎng)全身、調(diào)節(jié)排汗等三方面功能的概括。隨著科學(xué)技術(shù)的進步，學(xué)者們對于衛(wèi)氣實質(zhì)的研究主要涉及到了免疫、熱代謝等方面，這些研究多著眼于衛(wèi)氣的單一功能，偏離了中醫(yī)的整體觀念和《黃帝內(nèi)經(jīng)》衛(wèi)氣理論的原意。
　　代謝組學(xué)(metabolomics)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后興起的系

2、統(tǒng)生物學(xué)的新分支。它通過考察生物體系受刺激或擾動前后代謝產(chǎn)物圖譜及其動態(tài)變化來研究生物體系的代謝網(wǎng)絡(luò)。它跳過了生命體內(nèi)復(fù)雜的調(diào)控過程，通過對代謝物的分析給出最終的、整體的結(jié)果，這種在整體上展示生物體內(nèi)在的動態(tài)變化狀況的技術(shù)，避免了以往采用單一或少數(shù)幾個指標研究某種生理和病理變化的弊端，故而在方法學(xué)上具有融整體、動態(tài)、綜合、分析于一體的特點，符合中醫(yī)學(xué)整體性的原則，是一項比較適合中醫(yī)學(xué)研究的技術(shù)手段。
　　節(jié)律性是衛(wèi)氣運行的重要特征

3、。目前，對于衛(wèi)氣節(jié)律的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究多集中在年節(jié)律和日節(jié)律，月節(jié)律研究相對較少。但是，早在2000多年前的《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就提及了衛(wèi)氣的月節(jié)律，如《素問·八正神明論》云:“月始生，則血氣始精，衛(wèi)氣始行，月廓滿，則血氣實，肌肉堅，月廓空，則肌肉減，經(jīng)絡(luò)虛，衛(wèi)氣去，形獨居。”闡明了衛(wèi)氣的月節(jié)律變化?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn):生物節(jié)律大都由體內(nèi)的生物鐘調(diào)控。生物鐘有其自身調(diào)控反饋環(huán)路。在哺乳動物體內(nèi)，生物鐘的調(diào)控與若干鐘基因、鐘相關(guān)基因和鐘控基因及其蛋白

4、產(chǎn)物通過轉(zhuǎn)錄-翻譯-翻譯后事件的相互銜接有關(guān)。一個鐘基因的突變，就可導(dǎo)致節(jié)律的紊亂。因此，觀察鐘基因及其轉(zhuǎn)錄、翻譯水平的改變，是研究生物節(jié)律調(diào)節(jié)機制的最直接方法。
　　我們課題組曾以寒熱刺激法復(fù)制大鼠衛(wèi)氣虛證模型，并以正常大鼠血清為研究對象，進行衛(wèi)氣月生理節(jié)律的代謝組學(xué)研究。在前期的實驗研究基礎(chǔ)之上，我們首次對衛(wèi)氣虛證的造模方法進行了改良，以疲勞聯(lián)合寒熱交替法制作大鼠衛(wèi)氣虛證模型;選取月初、月中、月末3個時間，對正常及衛(wèi)氣虛證大鼠

5、的中樞免疫器官—胸腺進行代謝組學(xué)檢測，并對正常大鼠外周血淋巴細胞、胸腺細胞進行生物鐘相關(guān)基因測定。這樣從“小分子代謝物水平”和“生物鐘基因表達水平”等兩端入手研究衛(wèi)氣月節(jié)律，以推測兩者之間生命體內(nèi)復(fù)雜的調(diào)控過程。
　　本篇論文主要包括理論和實驗兩大部分:
　　第一部分 衛(wèi)氣月節(jié)律理論探討
　　目的:從古今文獻中發(fā)掘衛(wèi)氣的月節(jié)律理論、節(jié)律機制，并探討利用新技術(shù)平臺對衛(wèi)氣月節(jié)律展開深入、全面探索的可行性。
　　方法:

6、從生物節(jié)律的基因調(diào)節(jié)機制、衛(wèi)氣節(jié)律的中西醫(yī)研究現(xiàn)狀（重點是月節(jié)律）、以代謝組學(xué)和生物鐘基因共同研究衛(wèi)氣月節(jié)律的可行性探討等角度進行了詳細論述。
　　結(jié)論:目前關(guān)于衛(wèi)氣免疫的研究多著眼于某個或某幾個免疫指標上，缺乏整體研究。另外，關(guān)于衛(wèi)氣免疫節(jié)律的研究，較多的為年節(jié)律和日節(jié)律，月節(jié)律較少涉及。而以具有“整體性”和“動態(tài)性”特點的代謝組學(xué)技術(shù)和從基因水平上來共同研究衛(wèi)氣的月節(jié)律，意義重大。
　　第二部分 衛(wèi)氣月節(jié)律的實驗研究

7、r>　　實驗一:衛(wèi)氣虛證大鼠模型的建立及玉屏風(fēng)散的反證效果研究
　　目的:探索衛(wèi)氣虛證動物模型的建立方法并觀察玉屏風(fēng)散對模型的反證效果。
　　方法:將SD大鼠以疲勞聯(lián)合寒熱交替法制作大鼠衛(wèi)氣虛證模型，并與正常對照組、環(huán)磷酰胺組、寒熱刺激組及中藥干預(yù)組對比，觀察其在大鼠行為學(xué)、體重、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、脾臟細胞因子含量等指標的變化，以評價疲勞聯(lián)合寒熱交替法制作衛(wèi)氣虛證模型的科學(xué)性與合理性。
　　結(jié)果:通過對各組大鼠行為學(xué)

8、觀察發(fā)現(xiàn)，疲勞寒熱組的造模方法更接近中醫(yī)衛(wèi)氣虛證的宏觀評定標準。通過對各組大鼠體重、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、脾臟細胞因子含量等指標的統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn):與正常對照組比較，疲勞寒熱組上述指標均顯著下降(P＜0.05);與環(huán)磷酰胺組比較，上述指標無顯著差異(P＞0.05);與寒熱刺激組比較，上述指標均顯著下降(P＜0.05);中藥干預(yù)組較疲勞寒熱組各項指標顯著升高(P＜0.05)。
　　結(jié)論:疲勞聯(lián)合寒熱交替法造模是較為理想的中醫(yī)衛(wèi)氣虛證大鼠

9、模型造模方法。
　　實驗二:基于胸腺代謝組學(xué)的衛(wèi)氣月生理節(jié)律研究
　　目的:通過代謝組學(xué)技術(shù)，尋找在胸腺這一局部微環(huán)境下體現(xiàn)衛(wèi)氣月生理節(jié)律變化的小分子標志化合物。
　　方法:以秋分日所在農(nóng)歷月，確定分月初組、月中組和月末組。分別在農(nóng)歷2013年八月初一、八月十五、八月三十正午12:00選擇正常SD大鼠10只，取胸腺組織，進行代謝組學(xué)檢測，得到代謝譜數(shù)據(jù)后，采用SIMCA-P軟件對各組數(shù)據(jù)進行主成分分析(PCA)及偏最小

10、二乘法-判別分析(PLS-DA)等，并確定潛在標志物。
　　結(jié)果:(1)從三組的PCA圖及月中組與月初組、月中組與月末組的PLS-DA圖上看，月中組與月初組、月末組明顯分類，說明其代謝成分與另兩組有區(qū)別。(2)硫胺、鳥苷、皮質(zhì)醇呈現(xiàn)月初、月末低，月中高的趨勢，符合衛(wèi)氣月中強、月初月末弱的變化規(guī)律。
　　結(jié)論:正常SD大鼠衛(wèi)氣存在月節(jié)律變化，硫胺、鳥苷、皮質(zhì)醇可能是參與或調(diào)節(jié)衛(wèi)氣月節(jié)律的潛在生物標志物。
　　實驗三:基于

11、胸腺代謝組學(xué)的衛(wèi)氣虛證月節(jié)律研究
　　目的:通過代謝組學(xué)技術(shù)，尋找在胸腺這一局部微環(huán)境下，衛(wèi)氣虛證的小分子標志化合物，以及伴隨衛(wèi)氣虛證月節(jié)律波動的小分子標志化合物。
　　方法:實驗分月初、月中、月末三個時間進行。每次實驗開始之前，將30只SD大鼠以隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組和治療組，每組10只。對照組:常規(guī)飼養(yǎng)。模型組:給予疲勞聯(lián)合寒熱交替法造模。治療組:造模同疲勞寒熱組，每日造模后灌服玉屏風(fēng)散中藥配方顆粒劑。采用液相色

12、譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，對大鼠胸腺組織進行代謝物檢測，得到代謝譜數(shù)據(jù)后，采用SIMCA-P軟件對各時間的分組數(shù)據(jù)進行主成分、偏最小二乘法等分析，并確定潛在標志物。
　　結(jié)果:(1)從月初、月中、月末3個時間的3組PCA圖上看，模型組與對照組的代謝譜均明顯不同，均可以明顯分類。治療組與對照組分類不完全，部分融合在一起。(2)月初、月中、月末3個時間存在不完全相同的衛(wèi)氣虛證的潛在標志物。(3)皮質(zhì)醇、環(huán)腺苷酸伴隨衛(wèi)氣虛證一月之中均出現(xiàn)，呈現(xiàn)月

13、中高，月初、月末低的規(guī)律。
　　結(jié)論:衛(wèi)氣虛證SD大鼠衛(wèi)氣存在月節(jié)律變化，皮質(zhì)醇、環(huán)腺苷酸可能是伴隨衛(wèi)氣虛證月節(jié)律的潛在標志物。
　　實驗四:正常大鼠外周血淋巴細胞、胸腺細胞生物鐘基因Clock、Bmal、Per1表達的月節(jié)律變化
　　目的:觀察正常大鼠外周血淋巴細胞、胸腺細胞生物鐘基因Clock、Bmal、Per1表達的月節(jié)律變化
　　方法:以秋分日所在農(nóng)歷月，確定分月初組、月中組和月末組。分別在農(nóng)歷2013年

14、八月初一、八月十五、八月三十正午12:00選擇正常SD大鼠10只，斷頭取血及胸腺組織，并以RT-PCR技術(shù)檢測三組大鼠外周血淋巴細胞、胸腺細胞生物鐘基因Clock、Bmal、Per1 mRNA表達的變化。
　　結(jié)果:外周血淋巴細胞、胸腺細胞中Clock、Bmal、Per1基因mRNA的表達，月中組明顯高于月初組、月末組(P＜0.05），而月末組與月初組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:生物鐘基因Clock、B