晝夜節(jié)律的中醫(yī)理論探討及生慧湯對APP-PS1癡呆小鼠晝夜節(jié)律的影響.pdf

1、目的：
　　整理癡呆和晝夜節(jié)律的相關(guān)文獻(xiàn)，從中醫(yī)學(xué)理論角度對其進(jìn)行重新解讀，并結(jié)合本課題組的前期研究基礎(chǔ)，以晝夜節(jié)律紊亂為切入點(diǎn)，探討晝夜節(jié)律與老年性癡呆的關(guān)系和改善晝夜節(jié)律以防治老年性癡呆的作用機(jī)制。以APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠作為老年性癡呆動(dòng)物模型，觀察生慧湯治療老年性癡呆的作用及其對晝夜節(jié)律的影響，旨在為中醫(yī)治則治法理論研究和防治老年病的研究提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1.理論探討：搜集與癡呆和晝夜

2、節(jié)律有關(guān)的古今文獻(xiàn)，從中醫(yī)學(xué)理論角度對晝夜節(jié)律進(jìn)行分析歸納總結(jié)，探討晝夜節(jié)律在疾病診斷、治療、預(yù)后等方面的應(yīng)用，分析晝夜節(jié)律與癡呆的相關(guān)性。
　　2.實(shí)驗(yàn)研究：選用APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因癡呆模型小鼠，自發(fā)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)觀察小鼠24h自主活動(dòng)，Cosinor Matlab軟件余弦法分析小鼠自主活動(dòng)時(shí)間生物學(xué)特征；Morris水迷宮法檢測小鼠學(xué)習(xí)記憶能力；觀察小鼠24小時(shí)內(nèi)不同時(shí)間段尿量，ELISA法檢測尿中皮質(zhì)酮（CORT）含

3、量、晝夜海馬組織sAPPα含量；Real Time-PCR檢測小鼠下丘腦生物鐘基因mRNA和褪黑素（melatonin，MT）受體mRNA的表達(dá)；Western Blot法檢測節(jié)律相關(guān)基因蛋白含量、MT受體表達(dá)、海馬組織 Aβ1-40和 Aβ1-42蛋白含量；免疫組織化學(xué)法檢測生物鐘基因主要蛋白含量、海馬 CA1區(qū)Aβ1-40和Aβ1-42蛋白含量。分析生慧湯對APP/PS1小鼠晝夜節(jié)律的影響及其和APP代謝的相關(guān)性，并與陽性藥物MT進(jìn)

4、行比較。
　　結(jié)果：
　　1. APP/PS1小鼠在3月齡時(shí)自主活動(dòng)時(shí)間呈現(xiàn)典型的晝夜節(jié)律（P<0.05），4月齡和5月齡時(shí)，APP/PS1小鼠tall、tL顯著增加（P<0.05），自主活動(dòng)時(shí)間不具備典型的晝夜節(jié)律（P>0.05）。
　　2.空白組、MT組、生慧湯高低劑量組小鼠自主活動(dòng)時(shí)間均呈現(xiàn)典型的晝夜節(jié)律（P<0.05），其振幅排序依次為：生慧湯高劑量組>空白組>生慧湯低劑量組>MT組。水迷宮試驗(yàn)結(jié)果，與模型組比

5、較，其余各組小鼠的上平臺潛伏期均縮短(P＜0.01，P＜0.05)，游泳總路程均減少(P＜0.01，P＜0.05)；與 MT組比較，生慧湯低劑量組小鼠游泳總路程明顯增加（P＜0.05）。與模型組比較，各組小鼠的穿越平臺次數(shù)、目標(biāo)象限時(shí)間均明顯增加(P＜0.01，P＜0.05)，第1次抵原平臺時(shí)間明顯縮短(P＜0.01，P＜0.05)；與MT組比較，生慧湯低劑量組小鼠穿越平臺次數(shù)和目標(biāo)象限時(shí)間明顯減少(P＜0.05)。
　　3.尿量

6、檢測結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組全天和白晝尿量顯著性增多（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，MT組和生慧湯高劑量組白晝尿量顯著性減少（P<0.05，P<0.01），生慧湯高劑量組黑夜尿量顯著性增多（P<0.05）；與 MT組比較，生慧湯低劑量組白晝尿量顯著性增多（P<0.05）?？瞻捉M、MT組、生慧湯高低劑量組小鼠尿量均呈現(xiàn)典型的晝夜節(jié)律（P<0.05）。除模型組以外各組小鼠尿液CORT均呈現(xiàn)典型的晝夜節(jié)律（P<0.05）。

7、
　　4.小鼠下丘腦組織生物鐘相關(guān)基因Real Time-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組Per1 mRNA、Cry1 mRNA、ClockmRNA、Bmall mRNA和Rev-erbamRNA表達(dá)均下調(diào)。與模型組比較，MT組Per1 mRNA、Cry1 mRNA、ClockmRNA、Bmall mRNA、Rev-erba mRNA表達(dá)均上調(diào)；生慧湯高劑量組Per1 mRNA、Cry1 mRNA、ClockmRNA、Bm

8、all mRNA、Rev-erba mRNA表達(dá)上調(diào)；生慧湯低劑量組Per1 mRNA、Cry1 mRNA、ClockmRNA表達(dá)上調(diào)。
　　5.小鼠下丘腦組織MT受體Real Time-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組MT1mRNA、MT2mRNA表達(dá)下調(diào)。與模型組比較，MT組 MT1mRNA表達(dá)下調(diào)、MT2mRNA表達(dá)上調(diào)；生慧湯高劑量組MT1mRNA、MT2mRNA表達(dá)上調(diào)；生慧湯低劑量組MT1mRNA表達(dá)上調(diào)、MT

9、2mRNA表達(dá)下調(diào)。Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組小鼠海馬組織Per1、Bmall、Clock、MT1和MT2蛋白相對表達(dá)量下降(P＜0.01，P＜0.05)。與模型組比較，MT組小鼠下丘腦組織 Per1、Bmall、Clock蛋白相對表達(dá)量增加(P＜0.01，P＜0.05)；生慧湯高劑量組小鼠下丘腦組織Per1、Bmall、Clock、MT1和MT2蛋白相對表達(dá)量增加(P＜0.05)；生慧湯低劑量組小鼠下丘

10、腦組織 Per1蛋白相對表達(dá)量增加(P＜0.05)。與MT組比較，生慧湯高劑量組MT1和MT2蛋白相對表達(dá)量明顯增加（P＜0.01）；生慧湯低劑量組Per1、Bmall、Clock蛋白相對表達(dá)量減少(P＜0.05)，MT2蛋白相對表達(dá)量明顯增加（P＜0.05）。
　　6.海馬組織sAPPα含量檢測結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組海馬組織全天sAPPα含量明顯減少（P<0.01）。和模型組比較，MT組、生慧湯高劑量組海馬組織白天sAP

11、Pα含量明顯增多（P<0.01）；生慧湯低劑量組夜間sAPPα含量明顯增多（P<0.05）；MT組、生慧湯高低劑量組全天sAPPα含量明顯增多（P<0.05，P<0.01）。與 MT組比較，生慧湯高劑量組海馬組織白天sAPPα含量明顯增多（P<0.05），生慧湯低劑量組海馬組織夜間sAPPα含量明顯增多（P<0.05）。組內(nèi)比較，MT組海馬組織白天和夜間sAPPα含量具有顯著性差異（P<0.05）；生慧湯高劑量組海馬組織白天和夜間sAP

12、Pα含量具有顯著性差異（P<0.01）。與空白組比較，模型組小鼠海馬組織 Aβ1-40和 Aβ1-42蛋白相對表達(dá)量明顯增加(P＜0.01，P＜0.05)。與模型組比較，MT組、生慧湯高、低劑量組小鼠海馬組織Aβ1-40和Aβ1-42減少(P＜0.01，P＜0.05)。與MT組比較，生慧湯高劑量組Aβ1-40和Aβ1-42減少（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.中醫(yī)學(xué)從天人相應(yīng)、陰陽變化、五行更替、營衛(wèi)生會(huì)等方面對晝夜節(jié)

13、律有深入的認(rèn)識。晝夜節(jié)律廣泛應(yīng)用于中醫(yī)學(xué)對于疾病的診斷、治療、預(yù)后等方面。
　　2.AD和晝夜節(jié)律紊亂密切相關(guān)，兩者互為因果，相互促進(jìn)。AD患者可表現(xiàn)為晝夜節(jié)律紊亂，晝夜節(jié)律紊亂也可能是導(dǎo)致AD發(fā)病的危險(xiǎn)因素之一，并能加快AD的病理進(jìn)程。
　　3.生慧湯能夠改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。
　　4.生慧湯能夠改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的晝夜節(jié)律紊亂。
　　5.生慧湯改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠