分離純化的脂肪干細(xì)胞(CD34+CD31-)成軟骨分化能力的初步研究.pdf

1、種子細(xì)胞來(lái)源是限制軟骨組織工程應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵問(wèn)題。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose-derived stem cells，ASCs)來(lái)源豐富，取材容易，體外倍增速度快，免疫原性低，有望成為組織工程與再生醫(yī)學(xué)的理想種子細(xì)胞來(lái)源。然而脂肪組織經(jīng)酶消化后，得到的是基質(zhì)血管部分（Stromal vascular fraction，SVF），其中具有多向分化潛能的干細(xì)胞所占的比例較小，成軟骨能力較弱，需要對(duì)其進(jìn)行分離純化，提高ASCs的比例。新

2、鮮分離的干細(xì)胞中高表達(dá)CD34，通過(guò)流式分選技術(shù)，采用CD34和CD31這兩個(gè)標(biāo)志物對(duì)SVF進(jìn)行流式細(xì)胞分選(CD34+CD31-)，并將分離純化的ASCs用于組織工程化軟骨的構(gòu)建，為優(yōu)化軟骨組織工程種子細(xì)胞提供理論依據(jù)。
　　目的：從脂肪組織中分離純化CD34+CD31-細(xì)胞亞群，比較CD34+CD31-細(xì)胞亞群與未分選細(xì)胞的表面標(biāo)志，證實(shí)流式細(xì)胞分選CD34+CD31-細(xì)胞是分離純化ASCs的有效方法，并對(duì)CD34+CD31-

3、細(xì)胞亞群與SVF進(jìn)行成軟骨相關(guān)檢測(cè)，驗(yàn)證CD34+CD31-細(xì)胞亞群的成軟骨潛能。
　　1、脂肪干細(xì)胞的分離純化與表面標(biāo)志鑒定
　　方法:將脂肪抽吸術(shù)得到的脂肪組織經(jīng)膠原酶消化得到新鮮分離的SVF，對(duì)其進(jìn)行流式細(xì)胞分選，分選出CD34+CD31-的細(xì)胞亞群，即人脂肪干細(xì)胞(Humanadipose-derived stem cells，hASCs)，對(duì)hASCs(CD34+CD31-)和未分選細(xì)胞(SVF)的進(jìn)行干細(xì)胞表面標(biāo)

4、志物的流式分析。
　　結(jié)果:新鮮分離的SVF中CD34表達(dá)率約為88.37％。采用CD34和CD31(CD34+CD31-)對(duì)新鮮分離的SVF進(jìn)行分選，CD34+CD31-亞群約占66.74％且隨年齡增大，比例有所升高。CD34+CD31-亞群表面CD44、CD90、CD73均呈陽(yáng)性表達(dá)，且明顯高于SVF，CD45、CD105均為陰性表達(dá)。
　　2、二維培養(yǎng)條件下驗(yàn)證hASCs(CD34+CD31)的成軟骨潛能
　　方

5、法:將分選出的hASCs(CD34+CD31-)和SVF分別在二維（單層培養(yǎng)）條件下進(jìn)行成軟骨誘導(dǎo)，通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)成軟骨相關(guān)基因Aggrecan和Ⅱ型膠原及軟骨肥大基因X型膠原的表達(dá)，甲苯胺藍(lán)和免疫組化染色對(duì)軟骨基質(zhì)及Ⅱ型膠原進(jìn)行半定量檢測(cè)，比較hASCs(CD34+CD31-)和未分選細(xì)胞的成軟骨潛能。
　　結(jié)果:hASCs(CD34+CD31-)和SVF在成軟骨誘導(dǎo)14天后，Aggrecan、Ⅱ型膠原及X型

6、膠原表達(dá)量均上調(diào)，兩者相對(duì)表達(dá)量無(wú)差異，甲苯胺藍(lán)染色及Ⅱ型膠原染色均為陽(yáng)性，二者積分光密度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3、三維培養(yǎng)條件下驗(yàn)證hASCs(CD34+CD31-)的成軟骨潛能
　　方法:將分選出的hASCs(CD34+CD31-)和SVF分別在三維(pellet)條件下進(jìn)行成軟骨誘導(dǎo)，進(jìn)行大體觀察、HE、甲苯胺藍(lán)、番紅O及免疫組化染色，并檢測(cè)GAG含量，比較hASCs(CD34+CD31-)和未分選細(xì)胞的成軟骨潛能。

7、r>　　結(jié)果:hASCs(CD34+CD31-)組在三維條件下成軟骨誘導(dǎo)28天后，形成的pellet較SVF組更接近軟骨組織形態(tài)，甲苯胺藍(lán)、番紅O及Ⅱ型膠原染色均為陽(yáng)性，積分光密度均高于SVF組，GAG含量?jī)山M無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：1、新鮮分離的SVF中高表達(dá)CD34，年齡因素不影響SVF中CD34的表達(dá)。與SVF相比，采用流式分選得到的CD34+CD31-亞群高表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)志物，因而認(rèn)為通過(guò)流式分選可成功分離純化hASC