高成脂能力脂肪干細(xì)胞系的分離與純化.pdf

1、研究背景： 脂肪組織是修復(fù)全身各部位軟組織缺損的最佳選擇。臨床上自體成熟脂肪組織的移植，不論是脂肪塊或是脂肪顆粒的注射移植，均可能出現(xiàn)壞死、再吸收等問(wèn)題，導(dǎo)致術(shù)后長(zhǎng)期效果不佳。組織工程技術(shù)的出現(xiàn)，對(duì)組織器官的修復(fù)與替代治療產(chǎn)生了重大意義。 組織工程技術(shù)的首要條件就是種子細(xì)胞。由于胚胎干細(xì)胞受到倫理學(xué)和來(lái)源的限制，故目前使用最多的種子細(xì)胞即成體干細(xì)胞。作為種子細(xì)胞的成體干細(xì)胞主要有兩種來(lái)源，一是骨髓來(lái)源的骨髓干細(xì)胞(bon

2、emarrow-derivedstemcells，BMSCs)，另一種是脂肪組織來(lái)源的脂肪干細(xì)胞(Adipose-derivedstemcells，ASCs)。相對(duì)與BMSCs而言，ASCs取材容易，且細(xì)胞量足以滿足組織工程的需求，具有很大的優(yōu)勢(shì)。 但現(xiàn)有的研究表明，通過(guò)普通的酶消化法分離出來(lái)的ASCs是由極其復(fù)雜的各種細(xì)胞集合而成，成脂等各項(xiàng)誘導(dǎo)分化的能力及效率都不高。將ASCs進(jìn)行成脂誘導(dǎo)后兩周，其分化比例只為30％～40％

3、，同時(shí)ASCs其余的各項(xiàng)分化效率也低于BMSCs。因此，純化ASCs，提高其誘導(dǎo)分化效率，是優(yōu)化其成為最佳種子細(xì)胞來(lái)源之一的有效方法。 近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)，成熟脂肪細(xì)胞在某種環(huán)境中，可去分化回成纖維樣細(xì)胞狀態(tài)，這種退回到原始狀態(tài)的去分化細(xì)胞具有多向分化的潛能，且成脂分化能力要高于ASCs。然而這種去分化細(xì)胞的高成脂能力是否伴隨著某些表面標(biāo)志的表達(dá)，國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。所以，本實(shí)驗(yàn)欲比較去分化脂肪細(xì)胞與ASCs在表面標(biāo)志等各方面的不

4、同，尋求出高成脂細(xì)胞高表達(dá)的表面標(biāo)志，并希望能通過(guò)免疫磁珠分選，提純出高成脂系A(chǔ)SCs。 目的： 探索尋求與高成脂能力相關(guān)的干細(xì)胞表面分子，并通過(guò)分選，純化得到高成脂系A(chǔ)SCs，從而為提高脂肪組織工程的效率提供有效途徑。 方法： 1、從人脂肪組織中分離培養(yǎng)ASCs，成脂誘導(dǎo)分化ASCs，得到誘導(dǎo)后脂肪細(xì)胞。收集誘導(dǎo)后漂浮于培養(yǎng)基中的脂肪細(xì)胞，天花板貼壁培養(yǎng)10d，脂肪細(xì)胞貼壁后翻轉(zhuǎn)正常培養(yǎng)得到去分化脂肪細(xì)

5、胞。選擇同等代數(shù)兩種細(xì)胞，成脂誘導(dǎo)分化并用油紅O染色法鑒定其分化效率；細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞的表面標(biāo)志表達(dá)，并在上述三方面對(duì)ASCs和去分化脂肪細(xì)胞進(jìn)行比較，篩選出可能與高成脂能力相關(guān)的表面分子。 2、就篩選出的可能與高成脂能力相關(guān)的表面分子，用免疫磁珠分選法分別分選脂肪組織新鮮分離的間質(zhì)血管碎片(stromalvascularfractions，SVF)及培養(yǎng)后ASCs。流式細(xì)胞檢測(cè)分選前后細(xì)胞群體該表

6、面分子陽(yáng)性表達(dá)率；并對(duì)兩種分選出的細(xì)胞與未行分選的ASCs進(jìn)行成脂、成骨誘導(dǎo)，濉工。染色鑒定成脂誘導(dǎo)結(jié)果，茜素紅染色鑒定成骨誘導(dǎo)結(jié)果。 結(jié)果： 從吸脂術(shù)中獲得人脂肪組織，培養(yǎng)出ASCs。選擇第4代ASCs進(jìn)行成脂誘導(dǎo)，誘導(dǎo)13d起，收集誘導(dǎo)成熟的脂肪細(xì)胞，天花板貼壁培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中，多房的脂肪細(xì)胞貼壁并逐漸吐出脂泡，最終去分化為成纖維狀細(xì)胞。去分化細(xì)胞與ASCs相比，生長(zhǎng)曲線較一致說(shuō)明兩者具有相似的增殖能力；油紅O染色鑒

7、定成脂誘導(dǎo)結(jié)果表明去分化細(xì)胞的成脂分化效率高出ASCs約50％。兩種細(xì)胞在表面標(biāo)志的表達(dá)上，CD34、CD54的表達(dá)陽(yáng)性率有所差別：去分化細(xì)胞的CD34、CD54的表達(dá)為陽(yáng)性，而ASCs的表達(dá)均為陰性。 用CD54-PE免疫磁珠分選新鮮分離的SVF及經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后的ASCs。分選前，流式檢測(cè)一至三代ASCs，細(xì)胞CD54的表達(dá)率隨著代數(shù)的增加而降低。分選后，CD54的表達(dá)率在兩種細(xì)胞群體中均達(dá)到90％以上。繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)代后，從培養(yǎng)后A

8、SCs分離出的CD54陽(yáng)性細(xì)胞群體CD54表達(dá)率維持高水平，新鮮分離SVF中分離出的陽(yáng)性細(xì)胞CD54的表達(dá)則降至陰性，未分選的ASCs為陰性表達(dá)。分選后的細(xì)胞與未分選的ASCs成脂能力比較：從培養(yǎng)后的ASCs分離出的CD54陽(yáng)性細(xì)胞成脂分化率接近100％，未分選的ASCs成脂能力約為30％，而從新鮮分離的SvF中分選出的CD54陽(yáng)性細(xì)胞成脂分化率只為10％左右。成骨誘導(dǎo)結(jié)果：ASCs成骨能力為三種細(xì)胞中最佳，而從SVF分選出的CD54陽(yáng)

9、性細(xì)胞群的成骨效率最差。 結(jié)論： 1、本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較去分化細(xì)胞與ASCs在增殖能力、成脂分化能力與表面標(biāo)志表達(dá)等方面的差別，認(rèn)為去分化細(xì)胞是一種類(lèi)似于干細(xì)胞但較干細(xì)胞具有更高成脂分化能力的細(xì)胞。去分化細(xì)胞CD54、CD34的表達(dá)高于ASCs表明CD54、CD34的表達(dá)可能與高成脂能力相關(guān)。 2、CD54免疫磁珠分選經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的ASCs，能純化ASCs并分離出高成脂系干細(xì)胞。因而，CD54應(yīng)是高成脂系干細(xì)胞特異表達(dá)的