脂肪源性間充質(zhì)干細胞CD73陽性亞群體外分化能力評價.pdf

1、背景：
　　缺血性心臟病發(fā)病率和死亡率極高，嚴(yán)重威脅人類健康。心肌一旦梗死，心肌細胞數(shù)量迅速減少，疤痕組織替代正常組織結(jié)構(gòu)，心室發(fā)生退行性重塑，心肌泵血功能下降，導(dǎo)致心力衰竭。近幾年干細胞研究逐步深入，細胞移植被認為是一種極具臨床應(yīng)用前景的治療缺血性心臟病的再生醫(yī)學(xué)療法。在所有可供心肌移植的種子細胞中，脂肪源性間充質(zhì)干細胞(Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs)具

2、有分化為心肌細胞的潛能、易于獲得、細胞存儲量大以及倫理問題少，有望成為心肌修復(fù)最理想的干細胞之一。但是，ADMSCs是非均質(zhì)的細胞群，不同亞群生物學(xué)特性的差異在一定程度影響ADMSCs的應(yīng)用效果。因此，研究ADMSCs不同亞群的生物學(xué)特性、篩選向心肌分化的優(yōu)勢亞群，對加大研究針對性和提高臨床療效具有十分重要的意義。
　　目的：
　　以CD73為分選標(biāo)準(zhǔn)，分離、純化CD73陽性和CD73陰性的ADMSCs，研究兩個亞群的生物學(xué)

3、特性和向心肌分化、脂肪細胞分化、骨細胞分化潛能的差異，篩選出心肌分化優(yōu)勢亞群，為進一步開展細胞治療心肌疾患提供實驗參考。
　　方法：
　　1.流式細胞儀分選CD73+/CD73-ADMSCs亞群，HE染色觀測其形態(tài)，免疫熒光化學(xué)法檢測亞群的間充質(zhì)干細胞表面標(biāo)記CD73、CD90和CD105的表達。
　　2.5-aza誘導(dǎo)CD73+/CD73-ADMSCs亞群，細胞免疫熒光化學(xué)法檢測心肌特異性蛋白心肌肌鈣蛋白c-TnT，

4、Real-time PCR檢測c-TnT、Gata-4基因水平變化。
　　3.成脂肪誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)CD73+/CD73-ADMSCs亞群，油紅O檢測成脂肪細胞分化情況，分光光度計檢測評價亞群的成脂肪細胞分化能力。
　　4.成骨誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)CD73+/CD73-ADMSCs亞群，茜素紅檢測成骨細胞分化情況，Real-time PCR檢測骨細胞OST和RUNX2基因水平變化。
　　結(jié)果：
　　1.流式細胞儀分選出CD73陽

5、性和CD73陰性的ADMSCs，CD73-細胞以寬大扁平或方形細胞為主，表達CD105和CD90、不表達CD73;而CD73+ADMSCs主要是小細胞，形態(tài)特點呈細長形、三角形、星狀或紡錘狀，表達CD90、CD105和CD73。
　　2.成心肌誘導(dǎo)后，CD73+ADMSCs心肌特異性c-TnT表達率45.6％、CD73-亞群5.3％，基因水平上CD73+亞群也較陰性亞群高表達c-TnT、Gata-4(P＜0.01)。
　　3

6、.成脂肪細胞誘導(dǎo)后，CD73+ADMSCs與CD73-亞群油紅O染色均顯示陽性，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05）。
　　4.成骨細胞誘導(dǎo)后，CD73+ADMSCs與CD73-亞群茜素紅染色均顯示陽性，表達骨細胞特異性O(shè)ST和RUNX2基因，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.CD73+ADMSCs形態(tài)以小細胞為主，表達CD90、CD105和CD73;而CD73-細胞主多為大細胞，表達CD105和CD