RNA干擾人脂肪源性間充質(zhì)干細胞KGF基因?qū)π叵偕掀ぜ毎鲋车捏w外研究.pdf

1、目的:在血液科應(yīng)用放化療治療血液腫瘤成為最主要的治療途徑，但是化療及放療相關(guān)的胸腺損傷比較常見，有文獻報道，脂肪來源的間充質(zhì)干細胞可以促進胸腺的修復，但是目前機制尚不能明確，但有文獻指出脂肪源性間充質(zhì)干細胞可以分泌角質(zhì)細胞生長因子，而這種因子可以與位于胸腺上皮細胞的受體結(jié)合，進而促進胸腺上皮的增殖，本實驗旨在研究，在體外條件下，脂肪干細胞修復放化療損傷的胸腺的修復有可能是通過角質(zhì)細胞生長因子實現(xiàn)的。
　　方法：在無菌環(huán)境下分離提取

2、人的皮下脂肪組織，應(yīng)用眼科剪將其剪碎至1mm3小組織塊，應(yīng)用I型膠原酶及胰蛋白酶對其進行消化，制成單細胞懸液，按照一定細胞濃度分裝于若干培養(yǎng)瓶中，加入適量含有20％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基于標準環(huán)境下進行培養(yǎng)，定期換液，觀察原代細胞形態(tài)。應(yīng)用流式細胞術(shù)對干細胞進行鑒定。
　　首先篩選使 KGF基因沉默的最佳siRNA序列。應(yīng)用 siRNA target Designer設(shè)計軟件，選擇評分最高的交予銳博公司構(gòu)建KGF-siR

3、NA-1、KGF-siRNA-2、KGF-siRNA-3、empty-siRNA四組siRNA，分別應(yīng)用Lipofectamine RNAiMAX瞬轉(zhuǎn)的方式轉(zhuǎn)染人的脂肪源性間充質(zhì)干細胞，將轉(zhuǎn)染后的人脂肪源性間充質(zhì)干細胞分為5組即KGF-siRNA-1組、KGF-siRNA-2組、KGF-siRNA-3組、empty-siRNA4組以及空白對照組，有文獻指出在48小時后轉(zhuǎn)染效率最高，遂在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48小時后觀察細胞生長良好，應(yīng)用QT-P

4、CR篩選最佳序列。
　　通過篩選，發(fā)現(xiàn)序列3(KGF-siRNA-3)沉默效率最佳，進一步篩選KGF-siRNA-3使人脂肪源性間充質(zhì)干細胞基因沉默的最佳濃度，分別應(yīng)用Lipofectamine RNAiMAX瞬轉(zhuǎn)的方式轉(zhuǎn)染人的脂肪源性間充質(zhì)干細胞，在標準培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時，分為6組：組一：20umol/L、組二：30umol/L、組三：50umol/L、組四：100umol/L、組五：空質(zhì)粒組、組六：空白對照組，、有文獻指出在4

5、8小時后轉(zhuǎn)染效率最高，遂在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48小時后觀察細胞生長良好，應(yīng)用QT-PCR篩選最佳濃度。
　　應(yīng)用Western-blot檢測KGF基因沉默后48h及72h角質(zhì)細胞生長因子的表達。
　　誘導脂肪間充質(zhì)干細胞向脂肪細胞轉(zhuǎn)化，并通過Brdu增殖實驗對KGF基因沉默后的脂肪間充質(zhì)干細胞進行鑒定。
　　將KGF基因沉默后的人脂肪源性間充質(zhì)干細胞與人及小鼠的胸腺上皮細胞株在Transwell小室進行共培養(yǎng)（人脂肪源性干細

6、胞位于小室的下層，胸腺上皮細胞位于小室上層）作為基因沉默組，將KGF基因正常表達的人脂肪源性間充質(zhì)干細胞與人及小鼠的胸腺上皮細胞株在Transwell小室進行共培養(yǎng)（方法同前）作為基因正常表達組，同時設(shè)單純?nèi)思笆笮叵偕掀ぜ毎昱囵B(yǎng)組，應(yīng)用Brdu增殖實驗測定胸腺上皮細胞增殖，
　　近一步通過PI（碘化丙啶）單染的方法分析胸腺上皮細胞的細胞周期。
　　結(jié)果：
　　1.培養(yǎng)人脂肪源性間充質(zhì)干細胞6-8d后，細胞呈比較典型的

7、纖維狀，10-12d后鋪滿瓶底約90%左右。傳代后選取對數(shù)生長期細胞，用流式細胞儀檢測細胞表面抗原CD44陽性率93.7%，CD34陽性率為0.405%。
　　2.QT-PCR結(jié)果顯示：與空質(zhì)粒組相比，轉(zhuǎn)染48小時KGF-siRNA-1、KGF-siRNA-2、KGF-siRNA-3的人脂肪源性間充質(zhì)干細胞內(nèi)KGFmRNA水平分別下降了46.88%、30.12%、81.88%，其中KGF-siRNA-3對KGFmRNA的干擾作用最

8、明顯（P<0.05），而空載體轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組比較，差異無顯著性（P>0.05）。
　　3.進一步篩選KGF-siRNA-3使人脂肪源性間充質(zhì)干細胞基因沉默的最佳濃度，Realtime PCR結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染48小時KGF-siRNA-3(0.2ug)、KGF-siRNA-3（0.3ug）、KGF-siRNA-3（0.5ug）、KGF-siRNA-3（1.0ug）的人脂肪源性間充質(zhì)干細胞mRNA水平分別下降了33.22%、46.40

9、%、81.06%、42.35%，其中KGF-siRNA-3（0.5ug）轉(zhuǎn)染組對KGFmRNA表達干擾效果最明顯（P<0.05），而空載體轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組比較，差異無顯著性(P>0.05)。
　　4.RNA干擾KGF基因沉默后，48小時檢測角質(zhì)細胞生長因子表達，在基因沉默組、空白對照組、空質(zhì)粒組分別為（0.223±0.007）、（0.881±0.009）、（0.894±0.004），空白對照組蛋白表達與空質(zhì)粒組無顯著性差異，P>0

10、.05，基因沉默組蛋白表達較空質(zhì)粒對照組下降76.17%， P<0.05，72小時在各組的表達為（0.184±0.008）、（0.916±0.006）、（0.931±0.005），空白對照組蛋白表達與空質(zhì)粒組無顯著性差異，P>0.05，基因沉默組蛋白表達較空質(zhì)粒對照組下降80.24%，P<0.05。
　　5.對基因沉默的脂肪干細胞進行鑒定，誘導成脂結(jié)果顯示誘導14天的人脂肪源性間充質(zhì)干細胞油紅O染色陽性，應(yīng)用Brdu方法測定結(jié)果顯

11、示脂肪干細胞連續(xù)增殖。
　　6.應(yīng)用Brdu增殖實驗分別測定基因沉默組，基因正常表達組及單純?nèi)诵叵偕掀ぜ毎昱囵B(yǎng)組胸腺上皮細胞增殖情況：第1天各組增殖情況為（24.6±0.7）%、（38.3±0.7）%、（18.6±0.5）%，第2天各組增殖情況為（34.8±0.6）%、（46.1±0.6）%、（28.9±0.3）%，第3天各組增殖情況為（40.6±0.5）%、（52.4±0.8）、（35.5±0.4）%，結(jié)果顯示基因正常表達組的

12、增殖高于基因沉默組，P<0.05，有統(tǒng)計學差異。
　　7.應(yīng)用Brdu增殖實驗分別測定基因沉默組，基因正常表達組及單純鼠胸腺上皮細胞株培養(yǎng)組胸腺上皮細胞增殖情況：第1天各組增殖情況為（21.7±0.2）%、（36.8±0.6）%、（19.1±0.6）%第2天各組的增殖情況為（30.4±0.4）%、（45.8±0.7）%、（24.9±0.6）%第3天各組增殖情況為（35.9±0.7）%、（51.8±0.6）%、（31.5±0.3）%

13、，結(jié)果顯示基因正常表達組的增殖高于基因沉默組，P<0.05，有統(tǒng)計學差異。
　　8.應(yīng)用PI單染分別測定基因沉默組、基因正常表達組及單純?nèi)诵叵偕掀ぜ毎昱囵B(yǎng)組胸腺上皮細胞的細胞周期，計算與細胞增殖密切相關(guān)的S期細胞所占比例：第1天各組 S期細胞所占比例為（24.6±0.7）%、（38.3±0.7）%、（18.6±0.5）%，第2天各組 S期細胞所占比例為（34.8±0.6）%、（46.1±0.6）%、（28.9±0.3）%，第3天

14、各組S期細胞所占比例為（40.6±0.5）%、（52.4±0.8）%、（35.5±0.4）%，結(jié)果顯示第1～3天，基因正常表達組的 S期細胞所占比例均高于基因沉默組， P<0.05，有統(tǒng)計學差異。
　　9.應(yīng)用PI單染分別測定基因沉默組、基因正常表達組及單純鼠胸腺上皮細胞株培養(yǎng)組胸腺上皮細胞的細胞周期，計算與細胞增殖密切相關(guān)的S期細胞所占比例：第1天各組 S期細胞所占比例為（23.6±0.6）%、（37.3±0.7）%、（19.6

15、±0.7）%，第2天各組S期細胞所占比例為（25.9±0.6）%、（45.1±0.6）%、（28.9±0.4）%，第3天各組S期細胞所占比例為（40.9±0.5）%、（53.4±0.8）%、（35.5±0.2）%，結(jié)果顯示第1～3天，基因正常表達組S期細胞所占比例均高于基因沉默組，P<0.05，有統(tǒng)計學差異。
　　結(jié)論：
　　1.脂肪源性間充質(zhì)干細胞可以促進胸腺上皮細胞增殖，這種增殖作用可能是通過分泌角質(zhì)細胞生長因子完成的<