蛋白激酶Cβ-銜接蛋白氧化應(yīng)激通路在實(shí)驗(yàn)性氟中毒中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中的作用.pdf

1、目的：觀察慢性氟中毒大鼠腦組織以及體外培養(yǎng) SH-SY5Y細(xì)胞中蛋白激酶Cβ（Protein kinase Cβ，PKCβ）/銜接蛋白（p66shc）氧化應(yīng)激通路中 PKCβ、肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶（Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase，Pin1）、p66shc及磷酸化p66shc（phospho-p66shc）蛋白的表達(dá)，探討PKCβ/p66shc氧化應(yīng)激通路在實(shí)驗(yàn)性氟中毒神經(jīng)損傷機(jī)制中的作用。

2、　　方法：建立慢性氟中毒動(dòng)物模型：SD大鼠30只，雌雄各半,隨機(jī)分為3組，即正常對(duì)照組、低氟組（飲水氟含量10 mg/L，加入氟化鈉配制）、高氟組（飲水氟含量50 mg/L）；實(shí)驗(yàn)期為6個(gè)月。用氟離子選擇電極法測(cè)定大鼠尿氟含量；用 Morris水迷宮方法測(cè)定大鼠學(xué)習(xí)記憶能力；蘇木精伊紅（Hematoxylin eosin，HE）染色后光鏡下觀察大鼠腦組織皮質(zhì)形態(tài)學(xué)變化；免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)大鼠腦組織皮質(zhì)神經(jīng)元特異性標(biāo)志物神經(jīng)核抗原（Ne

3、uron-specific nuclear antigen，NeuN）的表達(dá)；用蛋白印跡（Western blotting）方法檢測(cè)動(dòng)物腦組織中PKCβ、Pin1、p66shc和phospho-p66shc的蛋白表達(dá)水平。建立氟中毒細(xì)胞模型：體外培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞，分為3組，即正常對(duì)照組、染氟組（500?mol/L NaF）、PKCβ抑制組（500?mol/L NaF和0.2?mol/L PKCβ抑制劑 LY333531）。用 CC

4、K-8法檢測(cè) SH-SY5Y細(xì)胞活性， Western blotting方法檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞中PKCβ、Pin1、p66shc和phospho-p66shc的蛋白表達(dá)水平，生化方法測(cè)定超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）活性及丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量，活性氧（Reactive oxygen species, ROS）試劑盒檢測(cè) ROS水平，線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒檢測(cè)線粒體膜

5、電位，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。
　　結(jié)果：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：低氟組和高氟組大鼠尿氟含量明顯升高，逃避潛伏期較對(duì)照組顯著延長、空間探索總次數(shù)顯著減少（P<0.05）；各組大鼠腦組織皮質(zhì)HE染色未見明顯病理形態(tài)改變。免疫組化結(jié)果顯示，低、高氟組大鼠腦組織中NeuN蛋白陽性表達(dá)較對(duì)照組明顯減少（P<0.01）。Western blotting結(jié)果顯示低、高氟組大鼠腦組織中PKCβ、Pin1、phospho-p66shc蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組。

6、體外培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：CCK-8細(xì)胞活性結(jié)果顯示，不同濃度 NaF培養(yǎng)細(xì)胞48小時(shí)后，500?mol/L NaF及以上濃度可明顯降低SH-SY5Y細(xì)胞活性（P<0.01），細(xì)胞活性與染氟劑量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。與對(duì)照組比較，染氟組細(xì)胞活性明顯降低（P<0.01），而 PKCβ抑制組細(xì)胞活性明顯改善（P<0.05）。染氟組細(xì)胞中PKCβ、Pin1、phospho-p66shc蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組（P<0.05）；PKCβ抑制組細(xì)胞中P

7、KCβ、Pin1、phospho-p66shc蛋白表達(dá)均低于染氟組（P<0.05）。染氟組細(xì)胞SOD活性明顯低于對(duì)照組（P<0.01），MDA含量明顯高于對(duì)照組（P<0.01），PKCβ抑制組改變不如染氟組明顯（P<0.05）。與對(duì)照組相比，染氟組細(xì)胞 ROS水平增加，線粒體膜電位降低，細(xì)胞凋亡率增加（P<0.05）；與染氟組相比，PKCβ抑制組細(xì)胞ROS水平降低，線粒體膜電位增加，細(xì)胞凋亡率降低（P<0.05）。
　　結(jié)論：氟中