CHOP基因敲除后抑制UUO誘導(dǎo)的小鼠腎臟纖維化的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　腎臟纖維化是各種慢性腎臟病終末期共同的病理改變,主要的病理特征是腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化。腎臟纖維化的產(chǎn)生是由于細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積，超出了腎臟的清除能力，最終造成腎病終末期（ESRD）不可逆的病理改變。目前并沒(méi)有針對(duì)腎臟纖維化有效的治療方法，ESRD患者只能依靠終身透析和腎臟移植維持生命。有大量充分的證據(jù)表明腎臟系膜細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的活化、腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、炎癥細(xì)胞（單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)

2、胞）的浸潤(rùn)以及細(xì)胞的凋亡是引起腎臟纖維化重要的細(xì)胞機(jī)制。TGFβ及下游信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白Smad的活化很早之前就已經(jīng)被證實(shí)是促進(jìn)腎臟纖維化形成最重要的分子調(diào)節(jié)機(jī)制，但是腎臟纖維化形成相關(guān)的細(xì)胞活化機(jī)制以及TGFβ表達(dá)的誘發(fā)因素并沒(méi)有完全闡述清楚。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）是細(xì)胞內(nèi)參與蛋白質(zhì)合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和修飾，以及脂質(zhì)合成和Ca2+儲(chǔ)存重要的細(xì)胞器。當(dāng)細(xì)胞受到諸如氧化應(yīng)激，缺血和缺氧等刺激時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)遭到破壞，影響蛋白質(zhì)的折疊，并最終引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

3、應(yīng)激（ER stress）的發(fā)生，持續(xù)存在而無(wú)法及時(shí)得到處理的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞的程序性死亡，即凋亡。大量文獻(xiàn)證實(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的細(xì)胞凋亡是機(jī)體遭受損傷后器官和組織重構(gòu)的影響因素。例如，在心肌纖維化和肝臟纖維化形成過(guò)程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被證實(shí)發(fā)揮了關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。然而，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在腎臟纖維化病理過(guò)程的具體調(diào)節(jié)機(jī)制并未有研究進(jìn)行闡述。目前僅有Chiang等人利用大鼠腎臟纖維化的模型研究證實(shí)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激確實(shí)是腎臟纖維化形成的促進(jìn)因素，并利用

4、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑證實(shí)腎臟細(xì)胞的凋亡程度與腎臟纖維化的程度是成正比的。
　　綜合上述結(jié)論，我們首次在慢性腎臟病患者腎臟纖維化形成過(guò)程中進(jìn)行了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的研究，并利用C/EBP同源蛋白質(zhì)（Chop）表達(dá)基因敲除小鼠的單側(cè)輸尿管結(jié)扎（UUO）模型分析了凋亡在腎臟纖維化中所發(fā)揮的細(xì)胞機(jī)制和分子機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)Chop蛋白質(zhì)表達(dá)缺失后對(duì)UUO誘導(dǎo)的小鼠腎臟纖維化具有顯著的保護(hù)作用。由于Chop表達(dá)的缺失，在很大程度上避免了腎臟細(xì)胞的凋亡和繼發(fā)

5、性死亡，從而減少了由死亡引起的高遷移率蛋白1（Hmgb1）的被動(dòng)釋放。與此同時(shí)，我們的研究結(jié)果還顯示Chop基因敲除可以抑制巨噬細(xì)胞主動(dòng)分泌Hmgb1。由此所產(chǎn)生的效應(yīng)是小鼠腎臟組織中細(xì)胞外的Hmgb1總量下降。主動(dòng)分泌或被動(dòng)釋放到細(xì)胞外的Hmgb1與細(xì)胞膜表面的Toll樣受體4（TLR4）結(jié)合，激活 MyD88-NFκB信號(hào)通路，最終促進(jìn) IL-1β的表達(dá)。高表達(dá)的IL-1β通過(guò)促使 Tgfβ/Smad2/3和Pi3k/Akt信號(hào)通路

6、的活化，促進(jìn)腎臟纖維化的形成。因此，Chop基因敲除后Hmgb1下游整條促進(jìn)先纖維化形成的信號(hào)通路被抑制了。
　　研究方法和結(jié)果：
　　前期，我們收集了慢性腎臟病終末期患者的腎臟活檢組織。通過(guò)組織病理學(xué)染色，我們觀察到終末期腎病患者的腎間質(zhì)纖維化明顯，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)顯著增加，與此同時(shí)，CHOP RT-PCR的檢查結(jié)果顯示患者CHOP mRNA的水平明顯高于正常人。
　　為進(jìn)一步揭示CHOP在腎臟纖維化中的影響和機(jī)制，我們

7、建立了Chop基因敲除小鼠模型。單側(cè)輸尿管結(jié)扎手術(shù)（UUO）是誘導(dǎo)動(dòng)物腎臟纖維化的經(jīng)典模型。所以我們采用UUO手術(shù)分別誘導(dǎo)Chop-/-小鼠和C57BL/6小鼠的腎臟纖維化。在 UUO術(shù)后14天，通過(guò)病理學(xué)的檢測(cè)，我們觀察到C57BL/6小鼠腎臟發(fā)生了嚴(yán)重的纖維化，腎間質(zhì)中有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管擴(kuò)張程度及蛋白質(zhì)管型明顯，腎小管刷狀緣幾乎未見(jiàn)。ER stress相關(guān)因子蛋白質(zhì)及mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果表明腎臟纖維化病理進(jìn)程伴隨ER

8、stress的發(fā)生。然而Chop基因敲除后可以明顯改善小鼠UUO術(shù)后的所造成的表型。形態(tài)學(xué)分析結(jié)果顯示，在相同手術(shù)過(guò)程處理下，Chop-/-小鼠的腎臟腎盂積水較C57BL/6小鼠明顯減少，腎臟皮質(zhì)厚度改變程度下降。與形態(tài)學(xué)的表型一致，Chop基因敲除后在極大程度上抑制了小鼠術(shù)后腎臟纖維化的發(fā)生，并減少了腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，改善了腎小管的擴(kuò)張程度，保存了腎小管刷狀緣的部分完整性。F4/80是小鼠巨噬細(xì)胞特異性表面標(biāo)志，我們通過(guò)組織化學(xué)染

9、色發(fā)現(xiàn)Chop-/-小鼠腎臟間質(zhì)中巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)目顯著下降。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)CHOP蛋白表達(dá)缺失在mRNA和蛋白質(zhì)水平均阻礙了纖維化相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)。雖然Chop處于ER stress調(diào)控通路的下游，但是可能由于正反饋機(jī)制的存在，ER stress相關(guān)蛋白的檢測(cè)結(jié)果顯示Chop基因敲除后ER stress信號(hào)通路上游因子的表達(dá)被抑制了。
　　由ER stress誘導(dǎo)表達(dá)的Chop蛋白主要功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞的程序性死亡（凋亡），但如果凋亡的

10、細(xì)胞數(shù)目超出了腎臟自身清除能力，細(xì)胞會(huì)發(fā)生繼發(fā)性死亡。死亡后的細(xì)胞被動(dòng)釋放Hmgb1。TUNEL是一項(xiàng)特異性高、敏感性好、表型直觀、操作簡(jiǎn)便的檢測(cè)細(xì)胞凋亡的技術(shù)。因此我們首先采用TUNEL檢測(cè)UUO術(shù)后小鼠腎臟凋亡細(xì)胞的數(shù)目，數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示Chop基因敲除后，腎臟凋亡細(xì)胞的數(shù)目明顯減少。隨后我們利用免疫印跡和RT-PCR技術(shù)檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，與TUNEL結(jié)果一致，Chop基因的敲除抑制凋亡的發(fā)生。乳酸脫氫酶（LDH）是細(xì)胞死亡

11、后釋放的酶體，其含量可以指示細(xì)胞死亡的情況。腎臟溶解物中 LDH的檢測(cè)結(jié)果提示Chop-/-小鼠死亡細(xì)胞數(shù)目減少，由此可以推測(cè)Chop蛋白表達(dá)的缺失阻礙了細(xì)胞的繼發(fā)性死亡。細(xì)胞外 Hmgb1的產(chǎn)生方式包括被動(dòng)釋放和主動(dòng)分泌，通過(guò)腎臟組織Hmgb1的免疫組織化學(xué)染色和體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)兩種方式產(chǎn)生的Hmgb1在Chop-/-小鼠中均減少。同時(shí)我們證實(shí)腎病終末期患者的腎臟同樣有大量 HMGB1的釋放。Toll樣受體2（TLR2）、T

12、oll樣受體4（TLR4）和RAGE為Hmgb細(xì)胞膜上特異性受體。免疫印跡檢測(cè)三種受體UUO術(shù)后在小鼠腎臟組織中的變化，檢測(cè)結(jié)果顯示TLR2和RAGE在UUO術(shù)后表達(dá)升高，但是Chop-/-小鼠和 C57BL/6小鼠腎臟中兩者的表達(dá)并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而 TLR4的表達(dá)在Chop基因敲除小鼠中受到抑制。TLR4通路下游調(diào)節(jié)因子MyD88/NFκB的表達(dá)與TLR4一致，在Chop敲除后下降。分泌到細(xì)胞外的Hmgb1可刺激巨噬細(xì)胞分泌白介素1β

13、（IL-1β），我們通過(guò)免疫印跡和ELISA檢測(cè)到IL-1β前體和IL-1β的表達(dá)下降。IL1β可通過(guò)直接和間接兩種方式促進(jìn)纖維化的形成。我們發(fā)現(xiàn)兩條通路相關(guān)的調(diào)節(jié)因子，在Chop基因敲除后表達(dá)量均下降。
　　結(jié)論：
　　在本篇論文中，我們以ER stress為切入點(diǎn)，Chop為焦點(diǎn)進(jìn)行腎臟纖維形成機(jī)制的研究。在腎病終末期患者的腎臟組織中，我們檢測(cè)到 ER stress相關(guān)蛋白表達(dá)量的增加。為進(jìn)一步闡述腎臟纖維化病理機(jī)制，我