黃芪維持氧化-抗氧化平衡抑制博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化.pdf

1、目的：
　　本研究通過氣道內(nèi)霧化博萊霉素制作肺纖維化小鼠模型，對黃芪治療后的小鼠肺組織行HE和Masson染色，測定黃芪治療后小鼠血清丙二醛(Malondialdehyde，MDA)MDA/總抗氧化能力(Tatol Anti-oxidant，T-AOC)比值、肺組織NADPH氧化酶2/4(NADPH Oxidase，Nox2/4)、超氧化物歧化酶1/2/3(Superoxide Dismutase，SOD1/2/3)、過氧化氫酶(

2、Catalase，CAT) mRNA及NOX2/4蛋白表達水平探討黃芪減輕肺纖維化的可能機制。該研究可能為我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥黃芪在肺纖維化治療中的應(yīng)用提供可供參考的實驗基礎(chǔ)，產(chǎn)生一定的社會價值和經(jīng)濟價值。
　　方法:
　　1.黃芪緩解博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化
　　將8周齡的雌性SPF級昆明小鼠隨機平均分為3組，對照組、博萊霉素組、黃芪治療組，并做以下處理:使用MicroSprayereTM霧化器吸取100ul博萊霉素溶液

3、（3mg/kg溶于100ul生理鹽水），將霧化器針頭從聲門插入小鼠氣道，緩慢進行霧化，對照組的小鼠霧化相同體積的生理鹽水，黃芪治療組小鼠在氣管內(nèi)霧化博萊霉素后，每日腹腔注射100ul的黃芪注射液（1.7g/kg稀釋至100ul），對照組和博萊霉素組小鼠每日腹腔注射相同體積的生理鹽水。造模的第14天處死各組小鼠，解剖各組小鼠，獲取肺組織標(biāo)本。將各組小鼠的肺組織浸泡在10％中性甲醛中進行固定，48h后，取出肺組織進行石蠟包埋，切片后行HE和

4、Masson染色，然后參照Mikawar[13]和Ashcroft[14]法對肺組織進行炎癥損傷和纖維化損傷評分。各組小鼠肺組織用勻漿器勻漿后分別提取總RNA和總蛋白，RT-PCR法測定α平滑肌肌動蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）的轉(zhuǎn)錄水平，Westernblotting檢測α-SMA的表達水平。
　　2.黃芪對博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠總體MDA/T-AOC的影響
　　將8周的齡雌性SPF級昆明

5、小鼠隨機平均分為3組，對照組、博萊霉素組、黃芪治療組，處理同上。造模的第14天處死各組小鼠，眼球取血法獲得小鼠全血標(biāo)本，3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘獲得血清，嚴(yán)格按照南京建成生物工程研究所研制的MDA試劑盒和T-AOC試劑盒的說明書進行檢測，測定各組小鼠血清MDA和T-AOC水平。
　　3.黃芪對博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠氧化相關(guān)基因的影響
　　將8周齡的雌性SPF級昆明小鼠隨機平均分為3組，對照組、博萊霉素組、黃芪治療組，處

6、理同上。造模的第14天處死各組小鼠，解剖小鼠，獲得肺組織標(biāo)本。各組小鼠肺組織用勻漿器勻漿，然后分別提取其總RNA和總蛋白，RT-PCR法測定NOX2、NOX4的轉(zhuǎn)錄水平，Western blotting檢測NOX2、NOX4的表達水平。
　　4.黃芪對博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠抗氧化相關(guān)基因的影響
　　將8周齡的雌性SPF級昆明小鼠隨機平均分為3組，對照組、博萊霉素組、黃芪治療組，處理同上。造模的第14天處死各組小鼠，解剖小

7、鼠，獲得肺組織標(biāo)本。各組小鼠肺組織用勻漿器勻漿，然后分別提取總RNA，RT-PCR法測定SOD1/2/3，CAT mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。
　　結(jié)果:
　　1.黃芪緩解博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化
　　1.1 肺組織HE染色:對照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁較薄，肺泡重?zé)o明顯紅細胞及炎細胞的浸潤;博萊霉素組小鼠肺組織出現(xiàn)彌漫性肺實變，肺泡壁明顯增厚，肺泡中有大量的炎細胞及少量紅細胞的浸潤，肺間質(zhì)有較多成纖維細胞;黃芪治療組小

8、鼠炎癥損傷程度居于對照組小鼠及博萊霉素組小鼠之間。參照Mikawar法進行炎癥損傷評分。三組小鼠肺組織炎癥損傷評分依次為1.50±1.73、7.75±0.96、4.5±0.58，博萊霉素組小鼠炎癥損傷評分較對照組明顯升高(P＜0.01)，黃芪治療組小鼠炎癥損傷評分較對照組明顯升高(P＜0.01)，但較博萊霉素組明顯下(P＜0.01)。
　　1.2 肺組織Masson染色:對照組小鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)相對完整，無明顯的炎細胞浸潤，無明顯

9、膠原纖維沉積;博萊霉素組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)較為紊亂，肺泡的結(jié)構(gòu)消失，出現(xiàn)大片彌漫性纖維化病灶和炎癥細胞浸潤，組織間可見大量藍色膠原纖維沉積;黃芪組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)基本完整，肺泡壁輕中度增厚，有少量的炎癥細胞浸潤和藍色膠原纖維的沉積。參照Ashcroft法進行纖維化損傷評分。三組小鼠肺組織纖維化損傷評分依次為1.50±0.58、7.25±0.50、3.25±0.50，博萊霉素組小鼠的纖維化損傷評分較對照組明顯升高(P＜0.01)，黃芪治療組小鼠

10、纖維化損傷評分較對照組明顯升(P＜0.01)，但較博萊霉素組明顯下降(P＜0.01)。
　　1.3 小鼠肺組織α-SMA mRNA轉(zhuǎn)錄水平:博萊霉素組小鼠肺組織α-SMAmRNA轉(zhuǎn)錄水平較對照組顯著升高（1.33±0.07 VS0.99±0.04，P＜0.01），黃芪治療組小鼠肺組織α-SMA mRNA轉(zhuǎn)錄水平較博萊霉素組顯著降低（0.99±0.05 VS1.33±0.07，P＜0.01），黃芪治療組小鼠肺組織α-SMA mRNA

11、轉(zhuǎn)錄水平與對照組無顯著性差異（0.99±0.05 VS0.99±0.04，P=1.00）。
　　2.黃芪對博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠總體MDA/T-AOC的影響
　　2.1 小鼠血清MDA水平:博萊霉素組小鼠血清MDA較對照組顯著升高（282.54±6.93 VS9.88±0.83，P＜0.01），黃芪治療組小鼠MDA較博萊霉素組小鼠顯著降低（9.02±2.89 VS282.54±6.93，P＜0.01），與對照組無顯著性差

12、異(9.02±2.89 VS9.88±0.83 P=0.788)。
　　2.2 小鼠血清T-AOC水平:博萊霉素組小鼠血清T-AOC較對照組顯著升高（15.01±1.06 VS9.44±1.26，P＜0.01），黃芪治療組小鼠T-AOC較對照組小鼠顯著升高（13.01±1.70 VS9.44±1.26，P＜0.01），與博萊霉素組無顯著性差異(13.01±1.70 VS15.01±1.06 P=0.068)。
　　2.3 小

13、鼠血清MDA/T-AOC水平:博萊霉素組小鼠血清MDA/T-AOC值較對照組顯著升高（18.90±1.52 VS1.06±0.17，P＜0.01），黃芪治療組小鼠MDA/T-AOC較博萊霉素組小鼠顯著降低（0.69±0.20 VS18.90±1.52，P＜0.01），與對照組無顯著性差異（0.69±0.20 VS1.06±0.17，P=0.575）。
　　3.黃芪對博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠氧化相關(guān)基因的影響
　　3.1 小

14、鼠肺組織NOX2 mRNA轉(zhuǎn)錄情況:博萊霉素組小鼠肺組織NOX2mRNA轉(zhuǎn)錄水平較對照組顯著升高（1.31±0.14 VS0.88±0.09，P＜0.01），黃芪治療組小鼠肺組織NOX2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平較博萊霉素組和對照組明顯下降(0.56±0.05 VS1.31±0.14,P＜0.01;0.56±0.05 VS0.88±0.09,P＜0.01)。
　　3.2 小鼠肺組織NOX4 mRNA轉(zhuǎn)錄情況:博萊霉素組小鼠肺組織NOX4m

15、RNA轉(zhuǎn)錄水平較對照組顯著升高（1.26±0.01 VS1.16±0.02，P＜0.05），黃芪治療組小鼠肺組織NOX4 mRNA轉(zhuǎn)錄水平較博萊霉素組和對照組明顯下降(0.71±0.08 VS1.26±0.01,P＜0.01;0.71±0.08 VS1.16±0.02,P＜0.01)。
　　3.3 小鼠肺組織NOX2蛋白表達情況:博萊霉素組小鼠肺組織NOX2蛋白表達水平較對照組顯著升高（0.41±0.01 VS0.17±0.01，

16、P＜0.01），黃芪治療組小鼠肺組織NOX2蛋白表達水平較博萊霉素組明顯下降(0.17±0.03 VS0.41±0.01，P＜0.01)，較對照組無顯著性差異(P=0.839)。
　　結(jié)論:
　　黃芪具有顯著的抗氧化作用，它對博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化有一定的緩解作用。黃芪的抗纖維化機制可能與遏制博來霉素所導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)細胞氧化損傷，維持機體的氧化/抗氧化平衡密切相關(guān)。黃芪抗氧化、抗纖維化機制的研究，為黃芪在IPF治療中的應(yīng)用提