POU4F1在黑素瘤中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　黑素瘤是一種起源于黑素細(xì)胞的皮膚惡性腫瘤，具有惡性程度高、死亡率高等特點(diǎn)。近年來，黑素瘤在全球范圍內(nèi)發(fā)病率呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)，已經(jīng)是歐美地區(qū)發(fā)病率增長(zhǎng)速度最快的惡性腫瘤之一。我國(guó)屬黑素瘤發(fā)病率較低地區(qū)，但由于我國(guó)人口基數(shù)大黑素瘤患者人數(shù)眾多，并且我國(guó)黑素瘤發(fā)病率也處于持續(xù)增長(zhǎng)狀態(tài)，因此對(duì)黑素瘤進(jìn)行深入的分子機(jī)制研究對(duì)提高黑素瘤的診療效果、提高國(guó)民健康水平具有重要意義。
　　根據(jù)以往研究，多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要分

2、子參與了黑素瘤的發(fā)生發(fā)展。BRAF和NRAS是MAPK通路中的關(guān)鍵蛋白激酶，在超過50％的黑素瘤病例中存在活化性基因突變，突變的BRAF和NRAS基因使MAPK通路過度激活促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞的增殖。PI3K通路中的抑制分子PTEN在黑素瘤中存在較高頻率的失活突變，突變的PTEN喪失對(duì)PI3K通路的抑制活性，從而促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞增殖。此外，較多研究證實(shí)起源于外胚層神經(jīng)嵴細(xì)胞的黑素細(xì)胞在其惡性轉(zhuǎn)化過程中神經(jīng)系統(tǒng)胚胎發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量增加。M

3、ITF是胚胎發(fā)育過程中促進(jìn)神經(jīng)嵴細(xì)胞分化為黑素細(xì)胞的重要轉(zhuǎn)錄因子，在部分黑素瘤患者腫瘤組織中高表達(dá)并發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用；神經(jīng)系統(tǒng)胚胎發(fā)育相關(guān)的SOX家族多種轉(zhuǎn)錄因子，如SOX2、SOX4、SOX9等均參與到黑素瘤細(xì)胞增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移等過程。近年研究發(fā)現(xiàn)，主要表達(dá)于胚胎早期神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的POU家族轉(zhuǎn)錄因子，如POU5F1、POU3F2等，在黑素瘤組織及細(xì)胞系中高表達(dá)并發(fā)揮促腫瘤作用。
　　POU4F1是POU轉(zhuǎn)錄因子家族中的重要分

4、子，在胚胎發(fā)育的早期表達(dá)于中樞神經(jīng)前體細(xì)胞。轉(zhuǎn)錄因子POU4F1可與Bcl-2基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合調(diào)控Bcl-2基因的表達(dá)，并可與 P53蛋白發(fā)生蛋白質(zhì)間相互作用調(diào)控其轉(zhuǎn)錄活性。通過以上作用，轉(zhuǎn)錄因子POU4F1可發(fā)揮促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)分化和抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用。腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)POU4F1具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，黑素瘤中POU4F1可保護(hù)細(xì)胞基因組DNA并降低DNA損傷程度，逆轉(zhuǎn)由于BRAF突變導(dǎo)致的細(xì)胞衰老現(xiàn)象，從而促進(jìn)黑素瘤的發(fā)生和發(fā)展。但

5、是目前尚缺少黑素瘤中轉(zhuǎn)錄因子POU4F1作用的全面研究，且POU4F1在黑素瘤細(xì)胞中的作用機(jī)制尚不清楚。因此，本課題旨在全面地檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子POU4F1在黑素瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用，并對(duì)其作用機(jī)制做進(jìn)一步的研究。
　　研究方法：
　　1.使用Real-time PCR對(duì)原代黑素細(xì)胞、黑素細(xì)胞系、黑素瘤細(xì)胞系，以及色素痣組織和黑素瘤組織中POU4F1 mRNA水平表達(dá)量的檢測(cè)。
　　2.通過Western blot檢測(cè)PO

6、U4F1在原代黑素細(xì)胞、黑素細(xì)胞系、黑素瘤細(xì)胞系以及色素痣組織和黑素瘤組織中的蛋白表達(dá)水平。
　　3.使用lipo3000轉(zhuǎn)染試劑將POU4F1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入Hs294T和A2058細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞過表達(dá)POU4F1
　　4. CCK8試劑對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞染色，比較POU4F1過表達(dá)組與對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)數(shù)量的差異。
　　5. AnexinⅤ-FITC和PI染色體系對(duì)POU4F1過表達(dá)組與對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

7、各組細(xì)胞中凋亡細(xì)胞的數(shù)量。
　　6. Western blot技術(shù)檢測(cè)過表達(dá)POU4F1細(xì)胞內(nèi)磷酸化ERK的含量。
　　7.使用克隆形成實(shí)驗(yàn)技術(shù)，對(duì)POU4F1過表達(dá)組與對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)兩周后細(xì)胞克隆數(shù)進(jìn)行比較，并分析兩組在ERK劑作用下細(xì)胞克隆形成數(shù)量的差異。
　　研究結(jié)果：
　　1.轉(zhuǎn)錄因子POU4F1在惡性黑素瘤細(xì)胞系和組織中的表達(dá)
　　各細(xì)胞系及組織中均存在POU4F1轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，且mRNA水平與

8、蛋白水平表達(dá)水平一致。細(xì)胞系中實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：中原代黑素細(xì)胞和黑素細(xì)胞系中 POU4F1轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量較低，而黑素瘤細(xì)胞系中 POU4F1表達(dá)量較高；組織中實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：黑素瘤組織中POU4F1蛋白表達(dá)量顯著高于色素痣組織（n=8，P<0.05）。
　　2.轉(zhuǎn)錄因子POU4F1在黑素瘤細(xì)胞中的作用
　　POU4F1低表達(dá)的黑素瘤細(xì)胞可外源地提高POU4F1的表達(dá)（約2.3倍，P<0.05）。過表達(dá)POU4F1的黑素瘤細(xì)胞相較

9、于對(duì)照組，細(xì)胞在轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒后第72小時(shí)和第96小時(shí)，細(xì)胞數(shù)量均明顯增高（P<0.001）。凋亡水平檢測(cè)結(jié)果顯示：在 H2O2刺激下，過表達(dá)POU4F1組細(xì)胞凋亡水平顯著低于對(duì)照組細(xì)胞（過表達(dá)組33.8%±1.25%，對(duì)照組20.2%±0.83%，P<0.01）。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果示：過表達(dá)POU4F1對(duì)黑素瘤細(xì)胞的遷移能力無顯著影響（過表達(dá)組135.7±6.8，對(duì)照組124±9.8，P>0.05）。
　　3.轉(zhuǎn)錄因子POU4F1

10、促黑素瘤細(xì)胞增殖機(jī)制的初步探討
　　過表達(dá)POU4F1的黑素瘤細(xì)胞內(nèi)，ERK的磷酸化水平顯著增高（約3.5倍，P<0.01）?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：過表達(dá) POU4F1組細(xì)胞克隆形成數(shù)顯著高于對(duì)照組（過表達(dá)組為542±3.4，對(duì)照組為304±3.9，P<0.001）；過表達(dá)POU4F1的細(xì)胞給予ERK抑制劑處理后，細(xì)胞克隆數(shù)顯著降低（過表達(dá)組為542±3.4，過表達(dá)+抑制劑組為126±2.6， P<0.001）。ERK上游激酶MA

11、P2K2基因啟動(dòng)子區(qū)存在POU4F1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，并且POU4F1過表達(dá)細(xì)胞內(nèi)MAP2K2的mRNA和蛋白水平均升高。
　　研究結(jié)論：
　　通過以上研究，我們證實(shí) POU4F1在黑素瘤中表達(dá)量高于原代黑素細(xì)胞及色素痣組織，并首次在黑素瘤細(xì)胞中明確了 POU4F1具有促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡的作用。針對(duì)POU4F1的促腫瘤增殖作用，我們進(jìn)一步探討了POU4F1對(duì)ERK活性的激活作用，提示 POU4F1通過激活 ERK活性