RBBP4在HIV轉(zhuǎn)錄與潛伏中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)所導(dǎo)致的艾滋病是目前最具有威脅性的傳染病之一。雖然高效的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(highly activeanti-retroviral therapy, HAART)能有效的抑制HIV病毒的復(fù)制并使病毒載量降低至檢測(cè)下限，但是由于HIV潛伏庫(kù)的存在，導(dǎo)致HIV不能被徹底清除，因此當(dāng)前HIV潛伏庫(kù)被認(rèn)為是從體內(nèi)徹底清除HIV的最后壁壘。HIV潛伏狀態(tài)本質(zhì)上是

2、一種可逆的轉(zhuǎn)錄沉默狀態(tài)，這種狀態(tài)的產(chǎn)生和維持涉及多種宿主轉(zhuǎn)錄抑制因子及表觀修飾復(fù)合體。結(jié)合在HIV前病毒基因組長(zhǎng)末端重復(fù)序列5'LTR(long terminalrepeat)上的宿主轉(zhuǎn)錄抑制因子及其募集的組蛋白脫乙?；窰DACs(histonedeacetylase)等表觀修飾復(fù)合體在HIV的轉(zhuǎn)錄沉默和潛伏的建立維持中起著重要作用。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤結(jié)合蛋白R(shí)BBP4(retinoblastoma binding protein4)，作

3、為組蛋白分子伴侶，通過與HDACs等表觀修飾復(fù)合體協(xié)同作用，可參與基因的轉(zhuǎn)錄沉默。但作為與HDACs密切關(guān)聯(lián)的RBBP4分子，它在HIV的轉(zhuǎn)錄以及潛伏中的作用還未見報(bào)道。因此，本文將對(duì)RBBP4在HIV轉(zhuǎn)錄和潛伏中的作用及機(jī)制進(jìn)行研究。
　　目的：
　　1.研究RBBP4在正常對(duì)照者、臨床HIV感染者和治療者外周血單個(gè)核細(xì)胞PBMC(peripheral blood mononuclear cells)中的表達(dá)變化，并在實(shí)驗(yàn)

4、室HIV感染的CEM-ss和TZM-bl細(xì)胞模型上對(duì)RBBP4的表達(dá)變化進(jìn)行驗(yàn)證;
　　2.研究RBBP4表達(dá)的改變對(duì)HIV產(chǎn)生的作用，并在HIV的轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)研究RBBP4對(duì)HIV LTR介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及RBBP4與HIV LTR啟動(dòng)子的結(jié)合;
　　3.進(jìn)一步在HIV的感染和潛伏模型中研究RBBP4對(duì)HIV轉(zhuǎn)錄和潛伏作用的機(jī)制，為HIV潛伏庫(kù)的清除提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　1.首先利用熒光定量PC

5、R檢測(cè)RBBP4分子在臨床HIV感染者（30例）、HIV治療者（30例）和健康對(duì)照（30例）的PBMCs中的表達(dá)變化。并在實(shí)驗(yàn)室HIV感染的CEM-ss和TZM-bl細(xì)胞模型上，利用熒光定量PCR、Western blot和免疫熒光技術(shù)，對(duì)RBBP4的表達(dá)變化進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。
　　2.通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)HIV LTR啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的螢火蟲熒光素酶活性，來研究RBBP4對(duì)HIV LTR啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控;利用凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(ele

6、ctrophoreticmobility shift assay, EMSA)研究RBBP4與HIV LTR上NF-κB(-115～-75)和NR2F1（-345～-319）結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合。
　　3.在293T細(xì)胞與pNL4-3轉(zhuǎn)染的細(xì)胞模型中，利用染色質(zhì)免疫共沉淀(chrmatin immunoprecipitation analysis，ChIP)研究RBBP4對(duì)HDAC1/2和NR2F1在LTR上結(jié)合的影響，并在HIV潛伏和

7、激活的CEM-Bru細(xì)胞中研究RBBP4、HDAC1、HDAC2和NR2F1在LTR上的結(jié)合變化。
　　結(jié)果：
　　1.發(fā)現(xiàn)RBBP4在臨床HIV感染者中的表達(dá)明顯高于HIV治療成功者和正常對(duì)照（P＜0.01;P＜0.01);在實(shí)驗(yàn)室HIV感染的CEM-ss和TZM-bl細(xì)胞模型中，RBBP4 mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯高于未感染的對(duì)照細(xì)胞，其結(jié)果與臨床發(fā)現(xiàn)一致;并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在CEM-ss和TZM-bl細(xì)胞模型中將RBBP4

8、干擾表達(dá)后再感染HIV，發(fā)現(xiàn)HIV病毒顆粒的產(chǎn)生明顯增加;
　　2.過表達(dá)RBBP4可減少上清HIV病毒顆粒、病毒載量、單間接轉(zhuǎn)錄本、多剪接轉(zhuǎn)錄本和未剪接轉(zhuǎn)錄本的產(chǎn)生;進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)RBBP4可抑制HIV LTR啟動(dòng)的本底轉(zhuǎn)錄以及NF-κB和Tat誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄;RBBP4可分別與HIV LTR(-454～+181)上的NF-κB結(jié)合位點(diǎn)(-115～-75)和NR2F1結(jié)合位點(diǎn)（-345～-319）結(jié)合。
　　3.RBBP4在

9、HIV LTR上結(jié)合的變化能影響NR2F1、HDAC1/2在LTR上結(jié)合，即RBBP4在HIV LTR上的結(jié)合增加，NR2F1、HDAC1/2在LTR上的結(jié)合也增加，組蛋白乙酰化水平降低，最后導(dǎo)致HIV上清P24和病毒顆粒的產(chǎn)生減少;在HIV潛伏的CEM-Bru細(xì)胞中，RBBP4、NR2F1、HDAC1/2在HIV LTR的結(jié)合明顯高于在激活狀態(tài)下的結(jié)合;在潛伏細(xì)胞中將RBBP4干擾表達(dá)后能促使HIV起始轉(zhuǎn)錄本增加。
　　結(jié)論：<

10、br>　　1.首次發(fā)現(xiàn)RBBP4在未經(jīng)治療的HIV感染者中表達(dá)升高，并在HIV感染的TZM-bl和CEM-ss細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)RBBP4的表達(dá)升高，表明HIV感染可誘導(dǎo)RBBP4表達(dá)增加;
　　2.RBBP4可抑制HIV LTR介導(dǎo)的本底轉(zhuǎn)錄;RBBP4可抑制由NF-κB和Tat誘導(dǎo)激活的HIV LTR轉(zhuǎn)錄;并能與LTR上的NF-κB結(jié)合位點(diǎn)(-115～-75)和NR2F1結(jié)合位點(diǎn)（-345～-319）結(jié)合;
　　3.RBBP4通