L1CAM在食管鱗癌中的表達(dá)及作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　食管癌在我國(guó)的消化系統(tǒng)腫瘤中占有重要的比例，河南省是食管癌的高發(fā)地區(qū)。食管癌在早期不易被發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)患者確診時(shí)已屬晚期階段，腫瘤的進(jìn)展快，容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。在我國(guó)的食管癌患者中，主要的病理類(lèi)型為食管鱗狀細(xì)胞癌(Esophageal Squamous Cell Carcinoma，ESCC)。隨著醫(yī)療事業(yè)的發(fā)展，食管癌的治療效果已取得了相當(dāng)大的進(jìn)步，但是仍有大部分的患者在治療后出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的情況，患者的生存期并未出現(xiàn)明顯的

2、改善，治療效果不佳。因此尋找新的食管癌的治療途徑就顯得尤為重要。隨著近幾年分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，腫瘤相關(guān)基因研究的深入，基因治療及分子靶向治療已經(jīng)成為目前腫瘤治療的新方向，而在這之中重要的是如何選擇特異性的分子靶點(diǎn)。
　　L1細(xì)胞粘附分子（L1 Cell Adhesion Molecule，L1CAM）屬于細(xì)胞粘附分子免疫球蛋白超家族。在研究的初始階段，L1CAM分子被發(fā)現(xiàn)是在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中起到重要的作用。后來(lái)發(fā)現(xiàn)它在腫瘤中也

3、出現(xiàn)有異常的表達(dá)，包括在卵巢癌，惡性黑色素瘤，乳腺癌，前列腺癌，子宮內(nèi)膜癌中，并且認(rèn)為L(zhǎng)1CAM與患者預(yù)后差和疾病的終末階段相關(guān)，提示L1CAM是一個(gè)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的基因。L1CAM作為靶向治療的靶點(diǎn)具有很多優(yōu)勢(shì)，首先這是一個(gè)在腫瘤進(jìn)程中很重要的分子，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，侵襲和轉(zhuǎn)移;在卵巢癌或者胰腺癌等多種腫瘤中高表達(dá)，可用于傳統(tǒng)化療療效不佳，預(yù)后差的患者;具有組織選擇性，L1CAM一般表達(dá)于成人器官的外周神經(jīng)和腎小管細(xì)胞。然而目前L1

4、CAM在食管鱗癌中的表達(dá)情況還屬未知，在食管癌進(jìn)展中的作用還不清楚。
　　本文通過(guò)對(duì)L1CAM在食管鱗癌中的表達(dá)及預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行分析，了解L1CAM在食管鱗癌中的表達(dá)及作用，跟患者的臨床參數(shù)相關(guān)性如何，和食管癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系怎樣，抑制L1CAM的表達(dá)能否抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖，侵襲及運(yùn)動(dòng)能力，在動(dòng)物模型中驗(yàn)證，并對(duì)L1CAM的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究。
　　第一部分:L1CAM在食管鱗癌患者中的表達(dá)及與患者臨床參數(shù)的分析
　　

5、方法:
　　1)用Real time PCR的方法檢測(cè)食管癌患者癌和癌旁正常食管黏膜組織中L1CAM的表達(dá)。
　　2)分析L1CAM mRNA表達(dá)水平與患者臨床病例參數(shù)之間的關(guān)系。
　　3)用免疫組化的方法檢測(cè)食管癌患者癌組織中L1CAM蛋白的表達(dá)。
　　4)分析L1CAM蛋白表達(dá)水平與患者臨床病例參數(shù)之間的關(guān)系。
　　5) L1CAM蛋白表達(dá)與食管癌患者預(yù)后的相關(guān)性分析。
　　結(jié)果:
　　1)

6、117對(duì)食管癌患者的癌組織中L1CAM mRNA的表達(dá)顯著高于癌旁正常食管粘膜組織，P＜0.01，癌中L1CAM表達(dá)水平高于癌旁兩倍以上的病例占56.41％。
　　2)L1CAM mRNA的表達(dá)水平與患者腫瘤的分化程度、侵襲程度和腫瘤的臨床分期具有顯著相關(guān)性，P＜0.05。
　　3)69例食管癌患者腫瘤組織中L1CAM蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為78.26％。
　　4)L1CAM蛋白的表達(dá)水平與患者腫瘤侵襲程度、分化程度、腫瘤的

7、分期及患者的生存顯著相關(guān)，P＜0.05。
　　5)L1CAM蛋白高表達(dá)組的患者的總生存率顯著低于L1CAM低表達(dá)組患者，P＜0.05。
　　小結(jié):
　　1)在食管癌患者的癌組織中L1CAM mRNA的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織，mRNA及蛋白的表達(dá)水平與患者的臨床病理參數(shù)相關(guān)。提示L1CAM可能在食管癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。
　　2)L1CAM蛋白的表達(dá)與患者的生存期顯著相關(guān)，提示L1CAM可能是判斷食管癌患

8、者預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)。
　　第二部分:L1CAM的表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞系TE1和EC1生物學(xué)行為的影響
　　方法:
　　1)用Real time PCR的方法檢測(cè)L1CAM在多種食管癌細(xì)胞系及正常食管永生化細(xì)胞中的表達(dá)水平。
　　2)構(gòu)建L1CAM穩(wěn)定低表達(dá)的shRNA慢病毒感染的TE1和EC1細(xì)胞。
　　3) CCK8的方法檢測(cè)L1CAM表達(dá)的下調(diào)對(duì)食管癌TE1和EC1細(xì)胞增殖的影響。
　　4)流式細(xì)胞術(shù)檢

9、測(cè)L1CAM表達(dá)下調(diào)對(duì)食管癌細(xì)胞周期和凋亡的影響。
　　5)在低粘附板中觀察L1CAM表達(dá)下調(diào)對(duì)食管癌細(xì)胞成球能力的影響。
　　6) Transwell系統(tǒng)觀察L1CAM表達(dá)下調(diào)對(duì)食管癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。
　　7)建立裸鼠移植瘤模型，觀察L1CAM表達(dá)下調(diào)對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響。
　　結(jié)果:
　　1)L1CAM在食管癌細(xì)胞TE1和EC1中表達(dá)相對(duì)較高，選擇這兩個(gè)細(xì)胞系構(gòu)建L1CAM穩(wěn)定低表達(dá)的食管癌

10、細(xì)胞。
　　2)用Real time PCR和Wester blot的方法驗(yàn)證L1CAM敲低的效率，即L1CAM在mRNA及蛋白水平表達(dá)降低。
　　3)L1CAM表達(dá)的降低能夠抑制食管癌細(xì)胞的增殖。
　　4)L1CAM表達(dá)的降低能夠阻滯食管癌細(xì)胞的周期于G0/G1期，并且使腫瘤細(xì)胞的凋亡增加。
　　5)L1CAM表達(dá)的降低能夠抑制食管癌細(xì)胞的成球能力。
　　6)L1CAM表達(dá)的降低能夠使腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的

11、能力減弱。
　　7)在裸鼠移植瘤模型中，L1CAM的表達(dá)降低使裸鼠腫瘤的形成能力減弱，形成腫瘤的體積和質(zhì)量均減小。
　　小結(jié):
　　1)L1CAM表達(dá)降低，能夠降低食管癌細(xì)胞的增殖及自我更新能力，阻滯細(xì)胞周期，降低食管癌細(xì)胞遷移和侵襲能力，提示L1CAM在食管癌的惡性行為中起到了重要的作用。
　　2)L1CAM表達(dá)降低，在裸鼠動(dòng)物模型中發(fā)揮抑制腫瘤的形成和發(fā)展的作用。
　　第三部分:L1CAM通過(guò)調(diào)控NF-

12、κB的活性促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的招募
　　方法:
　　1)細(xì)胞因子微球檢測(cè)技術(shù)分析L1CAM敲低以后食管癌細(xì)胞上清中細(xì)胞因子的變化，選出變化差異最大的因子，并用ELISA及Real time PCR進(jìn)行驗(yàn)證。
　　2)體外Transwell系統(tǒng)中檢測(cè)L1CAM表達(dá)降低以后對(duì)健康人外周血CD4+FOXP3+Treg細(xì)胞的招募作用的變化。
　　3)在裸鼠移植瘤模型中給裸鼠注射健康人外周血CD4+T細(xì)胞，驗(yàn)證L1CAM表達(dá)

13、降低對(duì)Treg細(xì)胞的招募作用的變化。
　　4)Real time PCR和免疫組化的方法檢測(cè)裸鼠腫瘤部位L1CAM、CCL22、FOXP3和CCR4的表達(dá)。
　　5)Western blot的方法檢測(cè)L1CAM表達(dá)降低后對(duì)NF-κB活性的影響，并用ELISA及Real time PCR檢測(cè)用NF-κB抑制劑處理以后的TE1細(xì)胞CCL22的表達(dá)水平。
　　6)用Real time PCR和流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測(cè)和分析食管癌

14、患者腫瘤組織中L1CAM mRNA的表達(dá)水平與腫瘤組織中Treg細(xì)胞的數(shù)量的相關(guān)性。
　　7)用Kaplan-Meier生存曲線分析食管癌患者腫瘤組織中CD4+FOXP3+Treg細(xì)胞所占比例與患者預(yù)后的相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　1)隨著L1CAM表達(dá)的降低，TE1細(xì)胞上清中CCL22的表達(dá)變化最明顯，呈顯著降低。
　　2)在體外試驗(yàn)中，L1CAM表達(dá)降低使CCL22表達(dá)下調(diào)，從而使招募到腫瘤細(xì)胞部位的Treg細(xì)

15、胞的數(shù)量明顯減少。
　　3)體內(nèi)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果表明，隨著L1CAM表達(dá)的降低，趨化到腫瘤部位的Treg細(xì)胞明顯減少。
　　4)在體內(nèi)試驗(yàn)中，L1CAM表達(dá)降低，使腫瘤部位CCL22、FOXP3、CCR4的mRNA及蛋白水平表達(dá)降低。
　　5)L1CAM表達(dá)降低可以抑制NF-κB的活性;使用NF-κB抑制劑處理腫瘤細(xì)胞TE1后，腫瘤細(xì)胞分泌CCL22的水平降低。
　　6)腫瘤患者癌組織中L1CA

16、MmRNA的表達(dá)與Treg細(xì)胞的數(shù)量呈正相關(guān)，P＜0.05。
　　7)食管癌患者腫瘤組織中Treg細(xì)胞所占越高，患者的預(yù)后越差。
　　小結(jié):
　　1)在食管癌細(xì)胞TE1中隨著L1CAM表達(dá)降低，TE1細(xì)胞表達(dá)的CCL22的水平降低，從而使招募的Treg細(xì)胞的數(shù)量減少。
　　2)在患者的腫瘤組織中L1CAM的表達(dá)與患者腫瘤組織中浸潤(rùn)的Treg細(xì)胞的數(shù)量呈正相關(guān)，并且Treg細(xì)胞的數(shù)量與患者預(yù)后具有相關(guān)性。
　

17、　3)L1CAM通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB的活性來(lái)調(diào)節(jié)CCL22的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1)L1CAM在食管癌患者的腫瘤組織中表達(dá)顯著升高，并且與患者的臨床病理參數(shù)及預(yù)后相關(guān)，說(shuō)明L1CAM在食管癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。
　　2)L1CAM的表達(dá)降低能夠降低食管癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的能力，阻滯細(xì)胞周期、增加腫瘤細(xì)胞的凋亡。
　　3)L1CAM的表達(dá)降低能夠下調(diào)食管癌細(xì)胞CCL22的表達(dá)，從而使招募到腫瘤部位的