Mir-7在逆轉(zhuǎn)黑素瘤vemurafenib耐藥中的作用及機制的研究.pdf

1、第一部分篩選vemurafenib耐藥的黑素瘤細胞的microRNA表達
　　目的：在vemurafenib耐藥的黑素瘤細胞中篩選并找到能逆轉(zhuǎn)耐藥的microRNA。
　　方法：建立在高濃度vemurafenib中穩(wěn)定生長的耐藥A375細胞株（下文均稱之為RA375），篩選vemurafenib耐藥RA375和原始A375細胞的差異microRNAs，進行qPCR驗證。在耐藥細胞RA375中進行Lipofectamine20

2、00轉(zhuǎn)染差異表達的microRNA模擬物或抑制物。CCK8法檢測加入vemurafenib后，轉(zhuǎn)染差異表達microRNA模擬物或抑制物的耐藥細胞RA375的細胞活力。
　　結(jié)果：與原始A375細胞相比，耐藥細胞RA375中有十個microRNAs表達上升:mir-514-3p，mir-129-1-3p，mir-509-3p，mir-629-3p，mir-937-5p，mir-3960，mir-1915-3p，mir-4281，m

3、ir-4634，mir-6090;同時還發(fā)現(xiàn)七個microRNAs表達下降：mir-19b-3p，mir-20a-5p，mir-17-5p，mir-20b-5p，mir-19a-3p，mir-18a-5p，mir-7（p﹤0.05）。其中，在耐藥細胞RA375中轉(zhuǎn)染mir-7 mimics后能逆轉(zhuǎn)耐藥（p﹤0.05）。結(jié)論： mir-7在耐藥細胞RA375中低表達，mir-7可能參與逆轉(zhuǎn)黑素瘤細胞對vemurafenib耐藥。
　

4、　第二部分 vemurafenib耐藥的黑素瘤細胞內(nèi)MAPK和PI3K/AKT信號通路的情況
　　目的：研究vemurafenib耐藥的黑素瘤細胞RA375中MAPK和PI3K/AKT信號通路情況。
　　方法： Western Blot方法比較原始A375細胞和耐藥細胞RA375受不同濃度vemurafenib作用后細胞內(nèi)MEK，ERK和AKT磷酸化的蛋白水平差異。Western Blot方法比較原始A375細胞和耐藥細胞R

5、A375細胞內(nèi)ERK和AKT磷酸化的蛋白水平差異。
　　結(jié)果：隨著vemurafenib劑量逐漸增加，72小時后，原始A375中MEK和ERK磷酸化蛋白水平逐漸下降，而磷酸化AKT蛋白水平逐漸升高。隨著vemurafenib劑量逐漸增加，72小時后，耐藥細胞RA375中MEK和ERK磷酸化蛋白水平無明顯下降，而磷酸化AKT蛋白水平維持不變。與原始A375細胞相比，耐藥細胞RA375中ERK的磷酸化蛋白水平升高；AKT的磷酸化蛋白水

6、平略下降。結(jié)論： vemurafenib耐藥的黑素瘤細胞RA375中，MAPK和PI3K/AKT這兩條信號通路活化，可能參與耐藥機制。
　　第三部分 Mir-7通過降低MAPK和PI3K/AKT信號通路的活化而逆轉(zhuǎn)黑素瘤對vemurafenib的耐藥
　　目的：探索mir-7在vemurafenib耐藥的黑素瘤細胞中的作用與機制。
　　方法： Western Blot方法檢測mir-7 mimics轉(zhuǎn)染耐藥RA375細

7、胞后細胞內(nèi)ERK和AKT磷酸化蛋白水平；mir-7 mimics轉(zhuǎn)染耐藥細胞RA375后皮下種植瘤體，比較一周后成瘤體積大小。
　　結(jié)果：與scramble組相比，過表達mir-7的耐藥細胞RA375在轉(zhuǎn)染72小時后細胞內(nèi)ERK和AKT磷酸化蛋白水平下降；裸鼠皮下種植過表達mir-7的耐藥細胞RA375一周后均成瘤，與scramble組相比，mir-7組可以抑制腫瘤生長（p﹤0.05）。
　　結(jié)論： mir-7可能通過降低M

8、APK和PI3K/AKT信號通路的活化而逆轉(zhuǎn)黑素瘤對vemurafenib的耐藥。
　　第四部分多個mir-7的靶基因參與調(diào)控黑素瘤對vemurafenib耐藥的機制
　　目的：進一步探索mir-7經(jīng)抑制MAPK和PI3K/AKT信號通路的活化而逆轉(zhuǎn)黑素瘤對vemurafenib的耐藥機制。
　　方法：Real-time PCR和Western Blot方法分別檢測原始A375和耐藥細胞RA375內(nèi)EGFR、IGF-1

9、R和CRAF三個基因的mRNA和蛋白水平；Real-time PCR和Western Blot方法分別檢測過表達mir-7的耐藥細胞RA375內(nèi)EGFR、IGF-1R和CRAF三個基因的mRNA和蛋白水平；CCK8法檢測在耐藥細胞RA375中轉(zhuǎn)染EGFR、IGF-1R和CRAF這三個基因的siRNA后耐藥細胞RA375的細胞活力；選用針對這三種基因的小分子抑制劑，EGFR抑制劑 gefitinib，IGF-1R抑制劑linsitinib

10、，CRAF抑制劑 GW5074。CCK8法檢測在這三種抑制劑對耐藥細胞RA375的細胞活力影響。結(jié)晶紫染色觀察這三種抑制劑對耐藥細胞RA375的細胞增殖影響。Western Blot方法檢測應(yīng)用這三種抑制劑后，耐藥細胞RA375中的ERK和AKT磷酸化蛋白水平的變化。
　　結(jié)果：與原始A375細胞相比，耐藥細胞RA375中EGFR、IGF-1R和CRAF三個基因的mRNA和蛋白水平均上升；與scramble組相比，過表達mir-7

11、的耐藥細胞RA375中EGFR、IGF-1R和CRAF這三個基因的mRNA和蛋白水平均明顯降低。轉(zhuǎn)染IGF-1R siRNA后對耐藥細胞RA375有輕度逆轉(zhuǎn)耐藥作用（p﹤0.05），轉(zhuǎn)染EGFR和IGF-1R的siRNA后對耐藥細胞RA375的逆轉(zhuǎn)耐藥作用不明顯。Gefitinib，linsitinib，GW5074三種抑制劑聯(lián)合使用對逆轉(zhuǎn)耐藥效果最為明顯（p﹤0.05），并可降低耐藥細胞RA375內(nèi)ERK和AKT的磷酸化蛋白水平。