多藥耐藥在鼻咽癌中的作用及藥物逆轉(zhuǎn)的相關(guān)研究.pdf

1、第一部分:人鼻咽癌標(biāo)本中多種耐藥基因的表達(dá)
　　目的:評(píng)估人鼻咽癌標(biāo)本中多種耐藥基因的表達(dá)，并初步探討多種耐藥基因的表達(dá)與治療療效之間的關(guān)系。
　　方法:收集2011年4月～2012年4月期間復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院鼻內(nèi)窺鏡室行鼻咽部新生物活檢的鼻咽部標(biāo)本，共172例，其中經(jīng)病理確診為鼻咽癌的標(biāo)本共75例。選擇在我院接受順鉑(Cisplatin，DDP)+5-氟尿嘧啶(Fluorouracil，5-FU)化療的病人，根據(jù)病

2、人的療效將其分為完全緩解(Complete remission， CR)和未完全緩解(nCR)。其中nCR共8例標(biāo)本。在CR中選擇8例病人作為A組，將8例nCR標(biāo)本作為B組。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real time PCR)檢測(cè)標(biāo)本中多藥耐藥基因的表達(dá)情況。檢測(cè)基因包括:二氫嘧啶脫氫酶(dihydropyrimidinedehydrogenase，DPYD)、胸苷磷酸化酶(thymidine phosphorylase，TYMP)、胸

3、腺肽合成酶(thymidylate synthase，TS)、乳清酸轉(zhuǎn)磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(orotatephosphoribosyl transferase，OPRT)、二氫葉酸還原酶(dihydrofolatereductase，DHFR)、亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolatereductase，MTHFR)、切除修復(fù)互補(bǔ)交叉基因1(excision repair crosscomplementing

4、 gene1，ERCC1)、表皮生長(zhǎng)因子受體(epi dermal growth factorreceptor，EGFR)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A(vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A)、多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug reslstance relation protein，MRP)、肺耐藥相關(guān)蛋白1(lung-resistance related protein1，LRP1)、乳腺

5、癌耐藥相關(guān)蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα(topoisomeeraseⅡ，TOP2A)。比較A、B兩組標(biāo)本中多藥耐藥基因表達(dá)之間的差異，并初步探討多藥耐藥基因的表達(dá)和治療療效之問(wèn)的關(guān)系。
　　結(jié)果:所有鼻咽癌標(biāo)本均不同程度表達(dá)多藥耐藥基因。B組鼻咽癌標(biāo)本相比A組而言， ERCC1和TS表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);其他基因表達(dá)差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

6、義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:鼻咽癌組織中存在多種多藥耐藥基因的表達(dá)，可能是影響鼻咽癌化療療效的重要因素。鼻咽癌的治療療效可能跟ERCC1和TS的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
　　第二部分:人鼻咽癌耐順鉑細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特性研究
　　目的:建立人鼻咽癌耐順鉑(DPP)細(xì)胞系HNE1/DDP，并研究其生物學(xué)特性，為后續(xù)體外研究腫瘤耐藥構(gòu)造模型。
　　方法:以DDP為誘導(dǎo)干預(yù)藥物，以人鼻咽癌細(xì)胞HNE1為親代細(xì)胞系，采用了

7、大劑量沖擊法與逐步增加劑量法相結(jié)合的方法，在培養(yǎng)基中逐漸增加DDP的濃度，體外連續(xù)培養(yǎng)，建成一株人鼻咽癌耐順鉑的細(xì)胞系，并命名為HNE1/DDP。比較兩種細(xì)胞對(duì)鼻咽癌常用化療藥物順鉑，卡鉑，5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-FU）和紫杉醇的毒性，觀察耐藥細(xì)胞和親本細(xì)胞之間形態(tài)差異，制作生長(zhǎng)曲線，并檢測(cè)兩種細(xì)胞的遷移和侵襲能力。
　　結(jié)果:我們歷時(shí)1年的時(shí)間成功地建立了人鼻咽癌耐順鉑細(xì)胞系HNE1/DDP，該細(xì)胞能在含

8、DDP1ug/ ml的培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長(zhǎng)并傳代，其對(duì)DDP的耐藥指數(shù)為14.75，并與卡鉑、5-FU和紫杉醇等多種鼻咽癌常用的化療藥物可以產(chǎn)生不同程度的交叉耐藥;耐藥細(xì)胞HNE1/DDP相比親本細(xì)胞HNE1增殖速度稍有下降，體外群體倍增時(shí)間(doubling time，TD)較親代細(xì)胞稍微延長(zhǎng)(41.85 h VS37.44 h);但這兩種細(xì)胞在遷移和侵襲能力方面無(wú)明顯差別。
　　結(jié)論:成功建立了能在含1ug/ml的順鉑培養(yǎng)液中穩(wěn)定

9、生長(zhǎng)和傳代的人鼻咽癌耐順鉑細(xì)胞系HNE1/DDP，該細(xì)胞具有多藥耐藥性，其生物學(xué)特性與親本細(xì)胞基本相似，能作為體外研究腫瘤耐藥的模型。
　　第三部分:鼻咽癌細(xì)胞多藥耐藥的表達(dá)及藥物逆轉(zhuǎn)研究
　　目的:探討鼻咽癌耐順鉑細(xì)胞HNE1/DPP和親本細(xì)胞HNE1之間多藥耐藥表達(dá)的差異，并初步研究利多卡因?qū)NE1/DPP細(xì)胞的藥物逆轉(zhuǎn)作用。
　　方法:采用RT-PCR，免疫熒光(Immunofluorescence，IF)和W

10、estern-Blot分別從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)鼻咽癌耐順鉑細(xì)胞HNE1/DPP和親本細(xì)胞HNE1之間多種多藥耐藥的表達(dá)。檢測(cè)的指標(biāo)如下，二氫嘧啶脫氫酶(dihydropyrimidinedehydrogenase，DPYD)、胸苷磷酸化酶(thymidine phosphorylase，TYMP)、胸腺肽合成酶(thymidylate synthase，TS)、乳清酸轉(zhuǎn)磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(orotatephosphoribosy

11、l transferase，OPRT)、二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)、亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)、切除修復(fù)互補(bǔ)交叉基因1(excision repair cross complementing gene1，ERCC1)、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）

12、、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A（vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A）、多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug reslstance relation protein，MRP)、肺耐藥相關(guān)蛋白1(lung-resistancerelated Protein1， LRP1)、乳腺癌耐藥相關(guān)蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα(topois

13、omeeraseⅡ，TOP2A)。同時(shí)采用線粒體膜電位法(JC-1)，活性氧(ROS)檢測(cè)法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡法（Annexin V-FICT/PI）初步探索利多卡因逆轉(zhuǎn)HNE1/DPP細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性。
　　結(jié)果:RT-PCR，IF和Western-Blot結(jié)果顯示，多藥耐藥基因在鼻咽癌耐順鉑細(xì)胞HNE1/DPP和鼻咽癌細(xì)胞HNE1中均有不同程度表達(dá)，且多種多藥耐藥基因表達(dá)存在差異。在培養(yǎng)液中加入小于毒副作用的利多卡因后，H