NF-κB-POU2F2-SLIT2-ROBO1信號(hào)通路在胃癌轉(zhuǎn)移中的作用研究.pdf

1、【研究背景和目的】轉(zhuǎn)移是胃癌患者死亡的主要原因，但是對(duì)胃癌轉(zhuǎn)移的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍知之有限。胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制一直是胃癌研究中的熱點(diǎn)，它涉及多個(gè)基因、多條信號(hào)通路的交互作用。研究發(fā)現(xiàn)那些調(diào)控、連接胃癌轉(zhuǎn)移的多條信號(hào)通路的關(guān)節(jié)點(diǎn)，對(duì)于理解胃癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，開發(fā)胃癌轉(zhuǎn)移治療的靶向藥物具有重要意義。轉(zhuǎn)錄因子可參與多種信號(hào)通路的調(diào)控。研究表明轉(zhuǎn)錄因子既可以作為癌基因又可以作為抑癌基因發(fā)揮作用，然而它們?cè)谖赴┺D(zhuǎn)移中的作用至今仍不清楚。我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)在其

2、他類型腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子POU2F2，在胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移中起著重要作用。我們發(fā)現(xiàn) POU2F2在有轉(zhuǎn)移的胃癌中呈高表達(dá)，但其在胃癌中異常表達(dá)的原因、意義、功能和調(diào)控機(jī)制都不清楚。
　　【方法】
　　1.用 WB的方法檢測(cè) POU2F2在正常胃上皮細(xì)胞及不同轉(zhuǎn)移能力的胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)。進(jìn)一步用免疫組化的方法檢測(cè)并分析了有轉(zhuǎn)移和無轉(zhuǎn)移的胃癌及配對(duì)癌旁組織中POU2F2的表達(dá)，并分析POU2F2的表達(dá)與胃癌預(yù)后的關(guān)

3、系。
　　2.通過調(diào)控 POU2F2表達(dá)，在體外及體內(nèi)分別驗(yàn)證 POU2F2在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。采用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)POU2F2下游可能的結(jié)合位點(diǎn)，并通過CHIP-Seq， EMSA以及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。并在功能學(xué)水平進(jìn)一步驗(yàn)證其對(duì)胃癌轉(zhuǎn)移的影響。
　　3.通過文獻(xiàn)回顧，篩選POU2F2上游潛在作用的靶基因。再次通過生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)該靶基因與POU2F2啟動(dòng)子區(qū)的可能結(jié)合位點(diǎn)。通過CHIP-Seq，EM

4、SA以及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證其相互作用。并且通過調(diào)控 POU2F2和 ROBO1的表達(dá)，分別在體外及體內(nèi)檢測(cè)該信號(hào)通路對(duì)胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用。
　　4.使用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-218對(duì)NF-κB/POU2F2/SLIT2/ROBO1信號(hào)通路多個(gè)位點(diǎn)的調(diào)控，進(jìn)而在功能學(xué)上檢測(cè)其對(duì)胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用。
　　【結(jié)果】
　　1.POU2F2蛋白在正常胃粘膜細(xì)胞系GES-1中幾乎不表達(dá)。與GES-1細(xì)胞相比，雖

5、然低轉(zhuǎn)移潛能的胃癌細(xì)胞（MKN28-NM，SGC7901-NM）中的POU2F2蛋白升高了2倍，但在高轉(zhuǎn)移胃癌細(xì)胞系SGC7901-M，MKN28-M中POU2F2的表達(dá)升高了約9倍。癌旁組織中POU2F2表達(dá)的陽性率為4.00％；胃癌組織中，POU2F2表達(dá)的陽性率為65.52%，然而僅有6.00%無淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胃癌組織中POU2F2表達(dá)陽性，而84.97%轉(zhuǎn)移性胃癌組織POU2F2表達(dá)陽性。POU2F2在胃癌中表達(dá)高于癌旁組織

6、者其腫瘤淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高，TNM分期較晚，患者生存期更短。
　　2.轉(zhuǎn)染POU2F2 shRNA的SGC7901-M細(xì)胞體外遷移、侵襲能力分別下降。裸鼠尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中，感染POU2F2 shRNA的SGC7901-M細(xì)胞在裸鼠的肺轉(zhuǎn)移灶明顯減少。同時(shí)轉(zhuǎn)染 POU2F2慢病毒表達(dá)載體可恢復(fù)細(xì)胞的高轉(zhuǎn)移能力。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)ROBO1為POU2F2可能的下游結(jié)合位點(diǎn)。CHIP-Seq，EMSA以及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步

7、證實(shí) POU2F2與 ROBO1基因的啟動(dòng)子區(qū)相結(jié)合。體內(nèi)及體外功能學(xué)實(shí)驗(yàn)分別顯示POU2F2通過ROBO1促進(jìn)胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移。
　　3.文獻(xiàn)回顧提示POU2F2可能是NF-κB的下游靶基因。通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，并結(jié)合CHIP-Seq，EMSA以及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了NF-κB與POU2F2基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合。激活NF-κB可增加POU2F2和ROBO1的表達(dá)并在體內(nèi)外均促進(jìn)胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。抑制 NF-κB的活性可看到相反

8、的表型。在 NF-κB激活的條件下，下調(diào) POU2F2的表達(dá)可降低 ROBO1的表達(dá)水平并使胃癌細(xì)胞體內(nèi)外的轉(zhuǎn)移能力隨之減低。用shPOU2F2敲除POU2F2后，再過表達(dá)ROBO1可使胃癌細(xì)胞恢復(fù)體內(nèi)外的轉(zhuǎn)移能力。
　　4.雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明miR-218可直接結(jié)合并同時(shí)調(diào)控POU2F2, IκK-β和ROBO1。體內(nèi)外功能學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示上調(diào)miR-218可抑制POU2F2, IκK-β和ROBO1的表達(dá)，并抑制胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)

9、移能力；相反，下調(diào) miR-218可引起 POU2F2, IκK-β和ROBO1的表達(dá)增高，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。于此同時(shí)，抑制POU2F2, IκK-β和ROBO1其中任一個(gè)的表達(dá)可看到類似miR-218過表達(dá)的表型；然而通過轉(zhuǎn)染不含有miR-218結(jié)合位點(diǎn)的載體來過表達(dá)IKK-β, POU2F2和 ROBO1，可部分逆轉(zhuǎn)因過表達(dá)miR-218而產(chǎn)生的抑制胃癌轉(zhuǎn)移的表型。
　　【結(jié)論】
　　1.POU2F2通過正性調(diào)控ROB